Тематика лабораторных занятий

Тематика лабораторных занятий по разделу «Общая микробиология» дисциплины «Ветеринарная микробиология и микология» представлена в таблице 1.

Таблица 1 – Тематика лабораторных занятий

№пп	Название разделов дисциплины	Тема лабораторного занятия	Трудоемкость (часов)
1.	Общая микробиология	1.1  Бактериологическая лаборатория. Иммерсионная система микроскопа.	2
		1.2 Приготовление и окрашивание бактериальных препаратов.	2
		1.3 Специальные методы окраски бактерий. Определение подвижности бактерий.	2
		1.4 Методы изучения морфологии грибов и дрожжей.	2
		1.5 Стерилизация. Питательные среды.	2
		1.6 Методы культивирования и выделения чистых культур микроорганизмов.	2
		1.7 Методы изучения культуральных и биохимических свойств бактерий.	2
		1.8 Изучение антибиотикочуствительности бактерий. Бактериофаги.	2
Всего:			16

Содержание лабораторных занятий

 

Тема 1 «Бактериологическая лаборатория, правила работы и техника безопасности в ней. Иммерсионная система микроскопа. Основные формы бактерий»

 

Цель – формирование знаний о правилах работы в микробиологической лаборатории, строении микроскопа, особенностях иммерсионной системы микроскопа, умений выделять морфологические особенности разных форм бактерий, работая с микроскопом, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации.

План

1. Бактериологическая лаборатория

2. Правила работы с иммерсионной системы микроскопа

3. Изучение морфологии бактерий

Материальное обеспечение: микроскопы, набор реактивов для микроскопирования, готовые окрашенные препараты (кокки, палочки, дрожжи), демонстрационные плакаты по теме занятия (Основные формы бактерий, Правила работы в лаборатории, Ход лучей в иммерсионной системе микроскопа).

Теоретический материал

Бактериологическая лаборатория – это государственное учреждение, имеющее специальное оборудование и штат подготовленных специалистов для производства микробиологических исследований.

Основная задача бактериологической лаборатории – диагностика болезней сельскохозяйственных животных, пушных зверей, рыб, пчел, а также проведение экспертизы молока, мяса и других пищевых продуктов и кормов.

Лабораторию размещают в отдельном здании, вдали от проезжих дорог.

Отделы и подразделения лаборатории: приемное отделение, бактериологический,

вирусологический, биохимический, серологический, бактериологическая кухня,

виварий.

Правила работы и техника безопасности в бактериологической лаборатории:

1. Входить в лабораторию и работать в ней только в спецодежде (халат, косынка или колпак, сменная обувь).

2. В помещении лаборатории не принимать пищу и воду, не курить, не допускать излишних разговоров и ненужных переходов.

3. Работать сидя на своем рабочем месте, соблюдать чистоту и аккуратность в работе, по окончанию работы руки тщательно вымыть, при необходимости продезинфицировать.

4. Использованные пипетки, предметные и покровные стекла, шпатели, ватные тампоны помещать в сосуд с дезинфицирующим средством. Пинцеты, бактериальные петли, иглы прожигать в пламени горелки.

5. Отработанные культуры, использованный микробный материал, трупы зараженных животных сдавать лаборанту для обеззараживания в автоклаве.

6. Предметы, случайно загрязненные зараженным материалом, подвергать немедленной дезинфекции.

Микроскоп – сложный оптический прибор, предназначенный для рассматривания мелких объектов, увеличивающий изображение изучаемых объектов в 500-3000 раз. Обычный биологический микроскоп состоит из 2-х систем: механической и оптической.

Механическая система состоит из: штатива с подставкой, к которому прикреплен предметный столик, тубус, «револьверная» насадка и винты для перемещения тубуса.

Оптическая система состоит из: окуляра, объектива, конденсора и зеркала.

Правила работы с микроскопом.

1. Переносить микроскоп, держа перед собой, только двумя руками.

2. Микроскоп удобно поставить на стол и равномерно осветить поле зрения. Для этого: поднять конденсор, открыть диафрагму, установить малый объектив, наблюдая в окуляр, поворотом зеркала добиться равномерного и яркого освещения поля зрения.

3. На предметный столик кладут препарат и исследуют в сухой или иммерсионной системе.

4. Сухая система – работа с малым (8-10) или средним (20-40) объективами – используют макро- и микровинты медленно и осторожно, не касаясь предметного стекла, добиваются четкого изображения объекта.

5. Иммерсионная система – работа с большим (иммерсионным) объективом (90). На препарат наносят каплю иммерсионного масла; глядя сбоку, объектив опускают в масло, не допуская соприкосновения с предметным стеклом. Смотря в окуляр, медленно поднимают тубус микроскопа до появления изображения объекта, затем микровинтом наводят наилучшую резкость и ясность изображения.

6. При работе с микроскопом не применять большого усилия во избежании порчи микроскопа.

7. По окончании работы необходимо: объектив протереть от масла салфеткой, протереть столик и опустить конденсор; револьвер перевести на малый объектив (8-10), опустить, подложив на столик под объектив, салфетку; сдать микроскоп в лаборантскую №306 (поставить в шкаф).

Основные формы бактерий:

1. Шаровидные (кокки) – монококки, диплококки, тетракокки, стрептококки, стафилококки, сарцины;

2. Палочковидные – истинные бактерии, бациллы, клостридии;

3. Извитые – вибрионы, спириллы, спирохеты.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Исследовать окрашенные мазки-препараты бактерий.

Этапы выполнения задания:

1 Настроить освещение поля зрения микроскопа, выбрать необходимую систему для исследования мазков-препаратов.

2 Внимательно изучить и зарисовать в тетрадь обнаруженные в поле зрения микроскопа бактериальные клетки.

3 Определить форму бактериальных клеток и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Исследовать окрашенные мазки-препараты дрожжей.

Этапы выполнения задания:

1 Настроить освещение поля зрения микроскопа, выбрать необходимую систему для исследования мазков-препаратов.

2 Внимательно изучить, зарисовать в тетрадь обнаруженные в поле зрения микроскопа дрожжевые клетки и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Дайте определение бактериологической лаборатории. 2 Обоснуйте правила работы в бактериологической лаборатории. 3 С чем связана опасность работы в микробиологической лаборатории? 4 Из каких частей состоит микроскоп? 5 Какие правила необходимо выполнять при работе с сухой и иммерсионной системами микроскопа? 6  Назовите основные формы бактерий. 7 Чем отличается строение эукариотной и прокариотной клеток?

 

Тема 2 «Приготовление и окрашивание бактериальных препаратов. Краски и красящие растворы. Методы окраски бактерий (простой и сложный – метод Грама)»

 

Цель – формирование знаний об анилиновых красителях и красящих растворах, умений приготовления мазка-препарата, окраски бактерий, оценить правильность выполнения микроскопических исследований, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации.

План

1. Краски и красящие растворы

2. Приготовление бактериальных препаратов

3. Методы окраски бактериальных препаратов – простой и метод Грама.

Материальное обеспечение: сухие анилиновые краски, микроскопы, набор красок, реактивов для микроскопирования, микробные культуры бактерий разных форм, демонстрационные плакаты по теме занятия (Анилиновые красители, основные формы бактерий).

Теоретический материал

Основное требование при работе с микроорганизмами – соблюдение асептики, т. е. таких условий, при которых в пробирку с изучаемой культурой не смогли бы попасть другие микроорганизмы (например, из воздуха, с предметов, используемых в процессе выполнения работы). Кроме того, нужно иметь в виду, что среди микроорганизмов многие условно патогенны, что требует повышенного внимания и аккуратности в работе. Для работы с микроорганизмами используют специальные бактериологические петли, иглы, шпатели. Бактериологические петли изготовляют из проволоки, которую закрепляют в специальных металлических держателях или впаивают в стеклянные палочки. Толщина игл и петель не должна превышать 0,5 мм. Выращивают микроорганизмы в стеклянной посуде: пробирках, колбах или чашках Петри. В пробирках микроорганизмы культивируют как в жидкой, так и плотной средах. Пробирки со средами и культурами при работе следует устанавливать на штативах. Бактериологическая петля прокаливается, пробки и край пробирки фламбируются. Если в работе используются суспензии микроорганизмов или культуры, выращенные на жидких средах, они берутся предварительно простерилизованной пипеткой, у которой широкий конец закрыт ватой. Такие пипетки стерилизуют и хранят завернутыми в бумагу (каждая отдельно).

Изучают микроорганизмы, изготавливая препараты из них. Для этого применяют чистые, хорошо обезжиренные стекла, на поверхности которых капля воды свободно растекается. С этой целью промытые и высушенные стекла хранят в растворе спирт-эфира (1:1). При микроскопировании можно использовать культуры, выращенные в жидких средах. Культуры, выращенные на плотных средах, можно суспендировать (развести) с помощью стерильной петли или иглы в капле стерильной жидкой среды или какого-нибудь раствора, но не водопроводной воды, до слабого помутнения.

В зависимости от цели исследования готовят прижизненные или фиксированные препараты.

Фиксированный (постоянный) препарат готовят следующим образом:

1) приготовить суспензию микроорганизмов методом, аналогичным вышеописанному;

2) с помощью стерильной бактериологической петли распределить суспензию тонким слоем на поверхности предметного стекла в виде пятна диаметром около 1 см;

3) высушить мазок на воздухе;

4) фиксировать мазок в пламени спиртовки. Для этого препарат три раза проводят в средней части пламени спиртовки. При этом микроорганизмы погибают, хорошо прикрепляются к стеклу, становятся более восприимчивыми к красителю. Можно вместо термической проводить химическую фиксацию, предусматривающую применение средств, вызывающих коагуляцию белков. В этом случае она осуществляется с помощью определенных химических веществ (например, метиловый, этиловый спирты, формалин) или различных смесей (например, уксусная кислота, абсолютный этиловый спирт и хлороформ – фиксирующая смесь Карнуа).

Для микроскопического исследования приготовленные мазки, высушенные и зафиксированные, подвергают окраске. Наиболее пригодными для окраски микробов являются анилиновые краски. Анилиновые краски поступают в продажу в виде сухих порошков, из которых в лабораториях приготовляют растворы. Сначала готовят насыщенные спиртовые растворы, сохраняющиеся впрок, но сами по себе непригодные для окраски бактерий. Из них приготовляют разведенные спиртоводные растворы, которые и применяют в повседневной практике.

Красители, у которых при диссоциации выделяются водородные ионы, придающие красителю кислый характер, называются кислыми. Они окрашивают (в виде аниона) вещества основной природы. Красители, у которых при диссоциации выделяются гидроксильные ионы называются основными.

В микробиологической практике кислые и основные красители используются в виде солей, так как они способны вступать в реакцию с кислотами и основаниями. Основные красители чаще применяются в виде солей соляной, реже уксусной и серной кислот; кислые красители - в виде натриевых или калийных солей.

Интенсивность окрашивающей способности красителя зависит от рН среды: основные красители окрашивают объект тем интенсивнее, чем более щелочная среда, кислые - чем более кислая.

Красители можно разделить на: позитивные и негативные. Позитивные красители окрашивают непосредственно клетки микроорганизмов. Они окрашивают клетки при комнатной температуре в течение 30-60 секунд. Негативные красители окрашивают пространство, окружающие клетки микроорганизмов. В результате клетки выглядят силуэтами на фоне красителя.

Таблица 2 – Красители основной природы

Красные: нейтральный красный, пиронин, сафранин, фуксин, тионин	Фиолетовые: геницианвиолет, кристаллический фиолетовый, метиловый фиолетовый
Синие: гематоксилин, виктория, метиленовый синий	Черный: индулин
Зеленые: метиловый зелёный, малахитовый зелёный	Коричневые: везувин, хризоидин

Таблица 3 – Красители кислой природы

Красные и розовые: кислый фуксин, эритрозин, флюоресцин

Черные: нигрозин

Желтые: конго, пикриновая кислота

Приготовление красок для простого окрашивания.

Фуксин (солянокислый, уксуснокислый или сернокислый розанилин, дериват трифенилметана) употребляется в микробиологической практике чаще всего. Он готовится в виде концентрированного карболового раствора — фуксина Циля, очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. В таком виде он употребляется только для объектов, с трудом воспринимающих окраску (кислотоупорные бактерии, споры).

Для окраски большинства бактерий фуксин Циля разводят в 10 раз дистиллированной водой, получая так называемый разведенный, или водный фуксин. Разведенный фуксин очень нестоек и поэтому приготовляется непосредственно перед окрашиванием препарата.

Карболовый фуксин (фуксин (основной) - 1 г, карболовая кислота кристаллическая - 5г, спирт 96° - 10 мл, глицерин - несколько капель, вода дистиллированная - 100 мл). Порошок фуксина тщательно растирают с карболовой кислотой в ступке, добавив несколько капель глицерина. Во время растирания приливают понемногу спирт. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу (без комков!), приливают понемногу, продолжая все время размешивать, дистиллированную воду. Дают постоять двое суток, после чего фильтруют.

Водный фуксин (карболовый фуксин - 1 мл, дистиллированная вода -9 мл).

Метиленовый синий готовится заранее в насыщенном растворе. (метиленовая синяя - 10 г, спирт 96° - 100 мл). Из этого раствора готовят щелочную синюю краску. Насыщенный спиртовой раствор метиленовой синей (профильтрованный) - 30 мл, едкий натр (или едкий калий) 1% - 1мл, дистиллированная вода ~ 100 мл. Раствор стоек и может долго храниться.

Окраска бывает простая и сложная.

Простая окраска заключается в нанесении на мазок какой-либо одной краски на определенное время. Чаще всего для простой окраски применяют водно-спиртовый 1:10 фуксин, метиленовую синьку и сафранин. При простой окраске микробные тела воспринимают цвет применяемой краски так же интенсивно, как и ядра клеток; в то же время цитоплазма и весь фон мазка (если это не мазок из чистой культуры) окрашиваются в тот же цвет, но несколько бледнее. Обычно фуксином 1:10 красят 10–30 с., а ме- тиленовой синькой – 2–10 мин. Фуксин и генцианвиолет окрашивает мазки более интенсивно. А при окраске метиленовой синькой получаются нежные, более изящные препараты. Восприятие окраски зависит не только от свойств красок, но и от свойств подвергаемых окраске микробов. Для окраски мазков пользуются растворами красок или красящей бумагой. Простота приготовления, удобство применения, а также возможность хранения красящих бумаг в течение неограниченно долгого времени явились основанием для широкого их использования при различных способах окраски. Окраска мазков растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя. Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2×2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осто- рожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой. Мазок после обсушивания фильтровальной бумагой должен быть совершенно сухим, в противном случае при соприкосновении оставшейся влаги с кедровым маслом образуется эмульсия и при микроскопии получится неясное изображение. Сложные методы окраски основаны на особенностях физико- химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в том, что один и тот же препарат обрабатывают несколькими красителями. После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Обмывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполное. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые кислото- и спиртоустойчивы, другие только кислотоустойчивы. Наконец, некоторые, например споры, энергично противостоящие воздействию всех обесцвечивающих веществ, относятся к группе краскоустойчивых.

Сложные методы окраски имеют дифференциально-диагностическое значение для характеристики изучаемого микроба. К сложным методам окраски относятся: окраска по методу Грама, окраска спор и т. д.

Все бактерии в зависимости от способности окрашиваться по Граму разделяются на две нетаксономические группы – грамположительные и грамотрицательные формы. Окраска предложена в 1884 г. датским ученым Х. Грамом и позволяет дифференцировать бактерии, принадлежащие к различным видам, но сходные по форме и размерам. При обработке мазков микроорганизмов генцианвиолетом, а затем йодом препарат, окрашенный в черный цвет, обладает свойством обесцвечиваться под действием спирта. При этом одни бактерии также обесцвечиваются, а другие окрашиваются в фиолетовый цвет. При дополнительной окраске (в частности, разведенным фуксином 1:10) обесцвеченные спиртом бактерии окрашиваются в красный цвет (грамотрицательные). Другие же, прочно удерживающие фиолетовую окраску (соединение йод + генцианвиолет), т. е. не обесцвечивающиеся спиртом, относятся к группе грамположительных бактерий. Различие в окраске объясняется особенностями химического строения бактерий и ультраструктурой клеточных стенок, которые постоянны для определенного вида. Клеточная стенка грамположительных бактерий содержит многослойный муреин со сравнительно часто расположенными сшивками. Белки грамположительных бактерий имеют более кислый характер и лучше окрашиваются основными красителями, чем у грамотрицательных бактерий. Кроме того, грамположительные бактерии содержат рибонуклеат магния, который взаимодействует с образующимся в процессе окраски комплексом и препятствует вымыванию его спиртом. На результат окрашивания оказывают влияние небольшие отклонения в условиях культивирования или в методе окраски, возраст культуры, кислотность среды (в кислой среде, как правило, все бактерии грамотрицательны).

Окраска по Граму производится следующим образом:

1) приготовить на предметном стекле три мазка из бактериальных культур: заведомо известной грамположительной, исследуемой и заведомо известной грамотрицательной;

2) все мазки одновременно высушить;

3) зафиксировать мазки в пламени спиртовки;

4) окрасить 1 %-м раствором генцианового фиолетового в течение 2 минут;

5) краситель слить и, не промывая мазки, залить их раствором Люголя на 1–2 минуты;

6) промыть препарат обильно водой;

7) одновременно на все три мазка нанести 96 % этиловый спирт на 30 секунд;

8) промыть препараты водой (при микроскопировании таких препаратов грамотрицательные бактерии бесцветны);

9) окрасить препараты фуксином течение 2 минут;

10) препараты высушить и микроскопировать.

Грамположительные бактерии окрашиваются в фиолетовый цвет, гра- мотрицательные – в розовый. При окраске по Граму необходимо точно соблюдать указанные сроки.

Модификацией окраски по Граму является способ Синева, при котором вместо жидкой краски генцианового фиолетового используют полоски фильтровальной бумаги, заранее пропитанные этой краской и высушенные. На фиксированный мазок помещают полоски окрашенной фильтровальной бумаги, на них наносят 2–3 капли воды. Остальные этапы окраски аналогичны классическому методу Грама.

Для определения принадлежности бактерий к таксономической группе используют также экспресс-метод Грезерсона (1979). На предметном стекле в капле 3 %-го раствора КОН готовится суспензия изучаемой культуры. При этом грамположительные бактерии коагулируют, а грамотрицательные образуют вязкую тянущуюся массу.

Теоретический материал по теме занятия студенты конспектируют в тетрадь и выполняют практические задания.

Практическое задание 1: Освоить методику приготовления прижизненных и постоянных препаратов, окрашенных простыми красителями.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить и исследовать с иммерсионным объективом прижизненные препараты культуры бактерий, окрашенные метиленовым синим.

2 Приготовить и исследовать с иммерсионным объективом постоянный (фиксированный) препарат культуры бактерий, окрашенный фуксином.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить форму бактерий и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 2: Выяснить отношение к окраске по Граму исследуемых культур.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из трех музейных микробных культур (№1, 2, 3), окрасить их методом Грама.

2 Выяснить принадлежность данных культур к группе грамположительных или грамотрицательных бактерий.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить отношение бактерий по методу Грама и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что такое «асептика»? Почему нужно ее соблюдать при работе с микроорганизмами? 2 Какая посуда используется для выращивания микроорганизмов? 3 Как правильно держать пробирку с микроорганизмами и петлю? 4 Какие свойства микроорганизмов исследуются на прижизненных и постоянных препаратах? 5 Какие анилиновые краски применяют при окрашивании микробных культур?6 Какими методами проводится фиксация микроорганизмов на предметном стекле? 7 Какие красители используют для окраски микроорганизмов? 8. Сколько времени требуется для окрашивания мазка фуксином или метиленовым синим? 9 Как приготовить и зафиксировать мазок из культуры микроорганизмов? 10 Почему необходимо хорошо просушить мазок для иммерсионной микроскопии? 11 Как приготовить растворы красок для окрашивания бактерий простым методом? 12 Для каких целей используют сложные методы окраски? 13 В чем сущность метода окрашивания бактерий по Граму? 14 Почему бактерии окрашиваются по-разному методом Грама? 15 Какова последовательность действий при окрашивании бактерий методом Грама? 16 Какие существуют модификации метода окрашивания по Граму? 17 В чем отличия грамположительных и грамотрицательных бактерий? 18 Какой компонент клеточной стенки является обязательным для грамположительных и грамотрицательных бактерий? 19 В чем сущность экспресс-метода Грезерсона? 20 Что значит «грамвариабельный»? 21 Какие методы окраски микроорганизмов называют сложными? Для чего они используются?

 

 

Тема 3 «Специальные методы окраски бактерий. Определение подвижности бактерий»

Цель – формирование знаний о специальных методах окраски мазков-препаратов, умений приготовить, окрасить препараты по методам Пешкова, Златогорова, Михина, Ольта, определения подвижности бактерий, оценить правильность выполнения микроскопических исследований, делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации.

План

1. Изучить методические указания к занятию № 3.

2. Приготовить мазки-препараты из бактериальных культур, окрасить методами Пешкова, Златогорова, Михина, Ольта, изучить в иммерсионной системе микроскопа, зарисовать микробные клетки в тетрадь и отчитаться преподавателю о проделанной работе.

3. Приготовить препараты «висячая» и «раздавленная» капля, определить подвижность микробных культур, отчитаться преподавателю.

Материальное обеспечение: микроскопы, набор красок, реактивов для окраски бактериальных спор и капсул, готовые мазки капсулообразующих бактерий, пробиркой со спорообразующей культурой, суточные культуры подвижных бактерий, демонстрационные плакаты по теме занятия (Метод Пешкова, Метод Златогорова, Метод Ольта, Метод Михина, Споры и капсулы возбудителя сибирской язвы, Методы определения подвижности бактерий, Жгутики бактерий).

Теоретический материал

Специальные методы окраски микробов основаны на особенностях физико-химического строения бактериальных клеток, спор, капсул. Эти методы окраски применяются для дифференциации микроорганизмов и изучения их клеточной структуры.

Спорообразование – это стадия покоя в жизненном цикле клетки, связана с неблагоприятным действием окружающей среды. Спорообразование характерно для 15 родов бактерий. Процесс образования эндоспор сложный и проходит несколько этапов. В клетке прекращаются восстановительные процессы, завершается репликация ДНК и заменяется метаболизм.

Сердцевина споры содержит рибосомы, различные ферменты, липиды. Центральную часть спор составляют белки и нуклеиновые кислоты. Она окружена ЦПМ, к которой прилегают зачаточный слой и далее мощный слой кортекоа. Снаружи спора одета многослойными покровами, их не менее трех: внутренний, средний, внешний. Покровы образованы белком с небольшой добавкой углеводов и липидов, который обеспечивает устойчивость ее к действию различных ферментов. В течение первых пяти часов спорообразования значительная часть белков материнской клетки распадается. При этом образуется специфическое для спор вещество – дипиколиновая кислота, В ходе синтеза дипиколиновой кислоты происходит поглощение ионов кальция. В зрелых спорах эта кислота составляет 10-15% сухого вещества.

В состоянии спор микрорганизмы обладают весьма высокой устойчивостью к действию высокой температуры, разного рода излучений и химических агентов. Терморезистентность обусловлена очень низким содержанием воды и приблизительно пропорциональна содержанию в ней дипиколиновой кислоты. Химическая устойчивость обусловлена непроницаемостью оболочки для многих веществ. Зрелые споры не проявляют никакой метаболической активности. У большинства бактерий споры заключены в экзоспориум (образование в виде свободного мешка).

Для выявления спор применяют специальные методы окраски. Они основаны на том, что перед окрашиванием оболочка клетки подвергается разрушению путем протравливания какой-либо кислотой (серной, соляной, карболовой, хромовой кислотами) при подогревании на пламени спиртовки. Одним из простых способов окраски является метод Златогорова.

Окраска спор по Златогорову. На фиксированный мазок накладывают фильтровальную бумагу, наносят карболовый фуксин, подогревают 5-10 мин. до отхождения паров (можно накладывать на мазок заранее окрашенные бумажки, нанести 3-5 капель воды и подогревать). Мазок обесцвечивают 3 %-ным раствором серной кислоты (соляной кислоты) 5-10 с, промывают водой, дополнительно окрашивают раствором метиленовой сини 2-5 мин. Промывают водой, высушивают, микроскопируют под иммерсией. Микрокартина: споры - красные, вегетативные клетки-синие.

Окраска спор по Пешкову. На подготовленный препарат наливают щелочной раствор метиленовой сини и кипятят 15-20 с. Смывают синь водой и дополнительно окрашивают 0,5 %-ным водным раствором нейтральрота 30 с. Промывают водой, высушивают и микроскопируют под иммерсией. Микрокартина: споры - синие или голубые, вегетативные клетки - розовые.

К спорообразующим бактериям относят: возбудителя сибирской язвы, возбудителей анаэробных инфекций (столбняка, ботулизма, брадзота, энтеротоксемии, дизентерии ягнят, злокачественного отека).

Капсула имеет многослойную фибриллярную структуру. Фибриллы определенных слоев располагаются параллельно или перпендикулярно по отношению к клеточной стенке. Основным химическим компонентом данной структуры являются полисахариды гомо-и гетерополимерной природы. Капсула некоторых видов бактерий состоят из полипептидов. Основная функция, капсулы - защитная. Она предохраняет клетку от действия различного рода неблагоприятных факторов внешней среды. У патогенных микроорганизмов наличие капсулы обычно сопряжено с высокой вирулентностью штамма, что связано с антифагоцитарной активностью капсулы. Капсула обеспечивает адгезию на различных субстратах, может содержать запасы питательных веществ. Утрата капсулы часто ведет к потере вирулентных свойств микроба. Для дифференциального окрашивания и обнаружения капсул микроорганизмов используют специальные методы.

Одним из простых и распространенных способов окраски капсул являются методы Михина и Ольта.

Окраска капсул по Михину. На фиксированный препарат наносят метиленовую синь и красят его в течение 3 мин. при подогревании, краску сливают и промывают водой, просушивают фильтровальной бумагой и микроскопируют под иммерсией.

Микрокартина: капсулы - бледнорозовые, тела клетки - синего цвета.

Окраска капсул по Ольту. Фиксированный мазок окрашивают свежеприготовленным 2-3 %-ным водным раствором сафранина в течение 1-3 мин. с последующим быстрым смыванием краски водой, высушивают наносят иммерсионное масло и микроскопируют.

Микрокартина: капсулы - бледно-желтые, тела бактерий - коричневые.

К капсулообразующим бактериям относят: возбудителей сибирской язвы, диплококковой инфекции, некоторых анаэробных инфекций.

Для прижизненных наблюдений наиболее часто готовят препараты «раздавленная капля» или «висячая капля».

Работу проводят в следующем порядке:

1) приготовить предметное и покровное стекла;

2) зажечь спиртовку;

3) взять пробирку со стерильной водой в левую руку и поместить её наклонно между большим и указательным пальцем на расстоянии 3–5 см от пламени;

4) в правую руку взять петлю, простерилизовать ее в пламени спиртовки, включая часть петледержателя, которая при работе помещается в пробирку;

5) мизинцем правой руки зажать пробку пробирки, повернуть, вынуть ее и держать, не касаясь окружающих предметов;

6) обжечь края пробирки и взять петлей каплю воды, поместить её на предметное стекло;

7) обжечь края пробирки и пробку, закрыть пробирку и поставить в штатив;

8) прожечь петлю;

9) открыть пробирку с культурой так же, как в п. 5;

10) стерильную петлю ввести в пробирку с культурой, охладить, прикоснувшись к внутренней поверхности пробирки, а затем взять ею небольшое количество микроорганизмов;

11) петлей с микроорганизмами сделать штрих на стекле внутри капли воды. После этого петлю прожечь и охладить, прикоснувшись к стеклу;

12) растереть штрих петлей круговыми движениями, чтобы получилась слегка опалесцирущая суспензия;

13) петлю прожечь;

14) полученную суспензию микроорганизмов накрыть покровным стеклом и микроскопировать.

Чтобы в поле зрения не было пузырьков воздуха, нужно, расположив покровное стекло под углом 40–45°, прикоснуться им к краю капли и, когда она распределится вдоль грани, осторожно накрыть каплю. Препарат можно подкрасить метиленовым синим (в концентрации 0,01–0,001), капнув непосредственно в препарат или поместив каплю красителя у края покровного стекла, с противоположной стороны – полоску фильтровальной бумаги. При изготовлении препарата нужно учитывать размер капли, который должен быть равен приблизительно объему двух рисовых зерен. Маленькая капля быстро высыхает, при большой покровное стекло плавает на поверхности капли, что мешает качественному изображению объекта при микроскопировании.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят очень маленькую, с четкими краями каплю суспензии микроорганизмов, как описано выше. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом переворачивают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно, и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения. Висячую каплю микроскопируют с плоским зеркалом и суженной диафрагмой.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить методы обнаружения спор и капсул, определения подвижности бактерий.

2 Усвоить методы окраски мазков-препаратов Пешкова, Златогорова, Михина, Ольта, «висячоя», «раздавленная» капля.

3 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Определить наличие спорообразования у исследуемых культур.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из музейных микробных культур (№ 1, 2), окрасить их методами Пешкова и Златогорова.

2 Выяснить наличие спорообразования у исследуемых культур.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить наличие, расположение, размер эндоспор и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 3: Определить наличие капсулы у исследуемых культур.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить мазки-препараты из музейных микробных культур (№ 1, 2), окрасить их методами Ольта и Михина.

2 Выяснить наличие капсулы у исследуемых культур.

3Изучить готовый (музейный) препарат капсулообразующих бактерий.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь, определить наличие, расположение капсулы и отчитаться преподавателю.

Практическое задание 4: Определить подвижность суточной микробной культуры.

Этапы выполнения задания:

1 Приготовить препараты «висячая», «раздавленная капля», провести посев в полужидкую среду музейной микробной культуры (№ 3).

2 Выяснить наличие жгутиков у исследуемой культуры.

3 Зарисовать обнаруженные микроорганизмы в тетрадь и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что такое споры бактерий? 2 Чем объясняется большая устойчивость спор в сравнении с вегетативной формой бактерии? 3 В чем заключается биологическое отличие спор бактерий от спор грибов? 4 Назовите некоторые виды спорообразующих бактерий.           5 На чем основаны методы окраски спор. 6 Что такое капсула, ее происхождение и значение? 7Поясните химическую структуру капсулы и условия капсулообразования. 8 Назовите виды капсулообразующих бактерий. 9 Назовите методы окраски капсул, в чем их сущность? 10 Перечислите методы окраски спор. 11 Поясните технику и сущность окраски капсул по Ольту, по Михину. 12 Как приготовить препараты «раздавленная капля», «висячая капля?»?

 

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: