К практическому занятию № 2

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ

К практическому занятию № 2

на тему: «Микроскопический метод исследования. Тинкториальные свойства и структура бактерий. Сложные методы окраски. Структура бактериальной клетки. Функциональные методы определения

Подвижности»

по программе дисциплины «Микробиология, вирусология»

по специальности - 31.05.01. «Лечебное дело» (уровень специалитета)

курс 2, семестр 4

Составитель: Зайцева Е.А., д.м.н., профессор кафедры Рецензент: Шаркова В.А., д.м.н., профессор, заведующая кафедрой

Владивосток - 2016

1. Тема занятия: «Микроскопический метод исследования. Тинкториальные свойства и структура бактерий. Сложные методы окраски. Структура бактериальной клетки. Функциональные методы определения подвижности»

2.Мотивация изучения темы. Микроскопический метод исследования - один из первых и наиболее часто используемых прямых способов обнаружения возбудителя в материале от больного. Зная морфологию (форму, величину, взаимное расположение особей), особенности восприятия красителей (тинкториальные свойства) и структуру бактерий можно:

- поставить диагноз, установить этиологию болезни;

- установить наличие и характер инфекционного заболевания;

- составить представление о возбудителе в исследуемом материале;

- изучить детали строения бактериальной клетки.

Это позволяет приобрести: умение выбирать оптимальный способ окраски, приготовить и оценить микропрепарат, что необходимо врачу любой специальности. Навыки чёткого воспроизведения простых и сложных методов окраски (Грама, Циля-Нильсена и др.) полезны для любого врача и необходимы для специалистов, занимающихся изучением туберкулёза и других социально значимых инфекционных заболеваний.

Цели занятия.

3.1. Общая цель: изучение темы направлено на формирование компетенций по ФГОС-03 по специальности 31.05.01 – Лечебное дел о: формировать способность и готовность использовать на практике методы гуманитарных, естественнонаучных, медико-биологических и клинических наук в различных видах профессиональной и социальной деятельности (ОПК-9), формировать умение работать с научной литературой, анализировать информацию, вести поиск, выделять основные положения, делать выводы, развивать личностные качества (ОПК-9). Активно использовать современные достижения науки, особенно подчеркивая роль отечественных ученых в разработке данной темы (ОПК-9). Познакомить с морфологией основных форм микроорганизмов, научить распознавать их в препаратах, дифференцировать представителей прокариотов (бактерий).

Научить:

- сложным способам окраски бактерий, их дифференциации;

- выявлению структурных элементов, в том числе защитных;

- функциональной оценке подвижности бактерий;

- анализировать информацию, полученную с помощью методов светооптической и других видов микроскопии (ОПК-9).

Конкретные цели и задачи.

В результате изучения темы студенты должны:

I уровень - «иметь представление» - обучающиеся способны идентифицировать объект (микроорганизм), дать его качественное описание (морфологию,), сформулировать характерные тинкториальные свойства, уметь объяснить технику и правила работы с микроскопом, знать методику выполнению сложного способа окрашивания микропрепаратов (по Граму).

________________________________________________________________________

II уровень - «знать» - обучающиеся способны воспроизвести учебный материал с требуемой степенью точности: дать характеристику морфологии и тинкториальных свойств микроорганизмов, с достаточной полнотой описать микроскопический метод диагностики; строение бактериальной клетки.

_____________________________________________________________________________

III уровень - «уметь» - приготовить и микроскопировать микропрепарат с помощью иммерсионного объектива и светового микроскопа; описать морфологические и тинкториальные свойства изучаемых микроскопических препаратов; пользоваться учебной, научной литературой, сетью Интернет для профессиональной деятельности; диагностировать возбудителей паразитарных заболеваний человека на препарате, слайде, фотографии.

________________________________________________________________________

IV уровень - «владеть» - навыками микроскопирования, анализа микропрепаратов и электронных микрофотографий; методами работы с биологическим, фазовоконтрастным, поляризационным, люминесцентным микроскопами; навыками анализа информации, полученную с помощью методов светооптической и других видов микроскопии, техникой приготовления микропрепаратов: мазков из чистых культур бактерий, из мокроты, гноя, слизи для обнаружения микроорганизмов; навыками окраски мазков простыми и сложными способами (по методу Грама, Циль – Нильсена, по Пешкову, Нейссеру, Леффлеру, Ожешко и др.); дифференциацией микроорганизмов по морфологическим признакам в микропрепаратах.

4. Этапы проведения практического занятия:

№ п/п	Название этапа	Цель этапа	Время
1	2	3	4
I. Вводная часть занятия			5-10 %
1.	Организация занятия	Мобилизовать внимание студентов на данное занятие	5
2.	Определение темы, мотивации, цели, задач занятия	Раскрыть практическую значимость занятия в системе подготовки к профессиональной деятельности, сформировать мотив и, как следствие, активизировать познавательную деятельность студентов	5-10
II. Основная часть занятия			80-90%
1	2	3	4
3.	Контроль исходных знаний, умений и навыков	Проверка готовности студентов к занятию, выявление исходного уровня знаний, умений и навыков	15-20
4.	Общие и индивидуальные задания на СРС в учебное время	Дифференцированное ориентирование студентов к предстоящей самостоятельной их работе	20-30
5.	Демонстрация методики	Показать ориентировочную основу действия (ООД)	20-30
6.	Управляемая СРС в учебное время	Овладение необходимыми общекультурными, профессиональными компетенциями, исходя из конкретных целей занятия	20-30
7.	Реализация планируемой формы занятия (семинар, практическая работа)	Контроль результатов обучения и оценка с помощью дескрипторов	45
8.	Итоговый контроль	Оценивание индивидуальных достижений студента, выявление индивидуальных и типичных ошибок и их корректировка	10-15
III. Заключительная часть занятия			5-10 %
9.	Подведение итогов занятия	Оценка деятельности студентов, определение достижения цели занятия. Преподаватель анализирует работу каждого студента. Подводит итоги занятия, делает выводы, определяет выполнение учебно-воспитательных целей, а также общий уровень подготовки студентов к занятию. Объявляет оценки студентам, отмечает хорошо и слабо подготовленных студентов, отвечает на вопросы.	5 -10
10.	Общие и индивидуальные задания на СРС во внеучебное время	Указание на самоподготовку студентов, ее содержание и характер	5

Ориентировочная основа действия (ООД) по проведению практического занятия (лабораторного, семинарского и т.д.).

1. Подготовить к проверке материалы по СРС (письменные ответы на вопросы домашнего задания, лекции по теме занятия).

2. Охарактеризовать и определить мотивацию, цель и задачи занятия.

3. Входной контроль уровня знаний.

4. Обсуждение выполнения приготовления стекол и способа окраски микропрепаратов.

5. Выполнить самостоятельно приготовление препарата и его окраску простым методом.

6. Итоговый контроль уровня знаний.

Задания для контроля уровня сформированности компетенций в учебное время.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ВЫПОЛНЕНИЮ ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ С ПОЛНЫМ РЕГЛАМЕНТОМ ПРОТОКОЛА ЗАНЯТИЯ И ЕГО ОФОРМЛЕНИЕМ

№	Наименование учебного элемента (задания)	Методическое решение	Регламент протокола
1.	Вводный контроль исходных знаний	Домашнее задание с коррекцией на занятии	Записать в протокол сложные вопросы
2.	Тинкториальные свойства бактерий, их химическая основа: - окраска по Граму - окраска по Циль – Нильсену; - модификация_Хузе	Приготовить препараты, окрасить. Приложение 1 Приложение 2	Записать в протокол. Микроскопировать, зарисовать
3.	Структура бактерий: Постоянные элементы: - оболочка (выявление по Пешкову); - нуклеоид (выявление по Фельгену); - зёрна волютина, окраска по Нейсеру и Леффлеру. Временные структуры: - капсулы (выявление по Бури, Бури- Гинсу); - споры (окраска по Ожешко)	Приложение 3 Приложение 4 Приложение 5 Приложение 6 Приложение 7	Зарисовать Зарисовать
4.	Подвижность бактерий. Жгутики, их виды, расположение. - окраска по Морозову, Леффлеру; - функциональные методы: висячей и раздавленной капель; - метод посева по Шукевичу и в полужидкий МПА по Пешкову	Изучить по атласу Приложение 8 Приложение 9 Приложение 10	Зарисовать Зарисовать на занятии. Зарисовать Зарисовать Зарисовать
5.	Тестовый контроль усвоения темы		Записать в протокол вопросы и ответы

6.3. Задания для самоконтроля подготовки к практическому занятию (тесты и эталоны).

Основная:

1. Лекция по теме.

2. Методическая разработка по теме.

3. Микробиология и иммунология / Под ред. академика РАМН, проф. А.А. Воробьева //М.: Медицина, 2008.464с.

4. Поздеев О.К. Медицинская микробиология /М.: ГЭОТАР-МЕД, 2008. 768 с.

5. Борисов Л. Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология /М., 2008. 736 с.

6. Борисов Л.Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. М., 2005. С. С. 30 – 40; С. 41-45.

7. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология. Под ред. Воробьева А.А. М., 2006. С. 17 – 50; С. 30-50.

8. Шаркова В.А., Забелина Н.Р., Воропаева Н.М., Диго Р.Н., Коршукова О.А., Карпенко Н.В. Учебно-методическое пособие к практическим занятиям по общей микробиологии, вирусологии и иммунологии для студентов медицинских вузов /Учебно-методическое пособие. 2011. Владивосток: Медицина ДВ. 179 с.

Дополнительная:

1. Коротяев А.И., Бабичев С.А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология. С-Пб, 2002. С. 7 - 32.

2. Медицинская микробиология. Под ред. Королюка А.М., Сбойчакова В.Б. С-Пб, 2002. С.21-29.

3. Биргер М.О. (под ред.) Справочник по микробиологическим и вирусологическим методам исследования. М., 1982. С. 20 -28.

4. Атлас по медицинской микробиологии, вирусологии и иммунологии. Под ред. Воробьева А.А., Быкова А.С. М., 2003. С. С.21 -29. С.78-82, 85-92, 141-181.

Приложение 1

Приложение 2

ОКРАСКА КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ МИКРОБОВ М. TUBERCULOSIS

МЕТОДОМ ЦИЛЬ – НИЛЬСЕНА

Техника окраски:

1. На фиксированный мазок кладут кусочек фильтровальной бумаги, не превышающий по размеру предметное стекло.

2. Наливают карболовый фуксин Циля (основной краситель) и осторожно нагревают мазок на горелке/спиртовке 3-5 минут до появления паров, после чего оставляют краситель, пока препарат несколько остынет.

3. Снять бумагу с фуксином и промыть препарат водой.

4. Окрашенный препарат обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) 3-5 сек или смесью 10 частей спирта и 1 части соляной кислоты в течение 1-2 мин или 95 % этиловым спиртом, содержащим 3% по объему хлористоводородной кислоты (HCl), несколько раз погружая предметное стекло с мазком в стаканчик с солянокислым спиртом, пока мазок на вид не станет бледно-розовый.

5. Препарат тщательно промыть водой.

6. Споласкивают его 96% этиловым спиртом (в лаборатории часто этот этап упускают).

7. Снова ополаскивают водой.

8. Докрашивают 3-5 мин водным раствором метиленового синего Леффлера (дополнительный краситель).

7. Препарат промыть водой, подсушить и микроскопировать.

Оценка результатов. Кислотоустойчивые микроорганизмы окрашиваются в рубиново-красный цвет, некислотоустойчивые – в сине-голубой.

В МОДИФИКАЦИИ ХУЗЕ

Техника окраски:

1. Мазок окрашивают карболовым фуксином Циля (основной краситель) при нагревании 3-5 минут или окрашенной фуксином бумагой до появления паров, но, не доводя краситель до кипения.

2. Препарат остудить, снять бумагу, слить краситель и промыть водой.

3. Обесцвечивают 5% раствором серной кислоты (дифференцирующее вещество) в течение 1-2 мин.

3. Остаток кислоты слить, препарат промыть водой и обработать этанолом 20 сек.

4. Докрашивают 3-5 мин водным раствором метиленового синего Леффлера (дополнительный краситель).

5. Препарат промыть водой, подсушить и микроскопировать.

Оценка результатов. М. tuberculosis к этанолу устойчивы и не обесцвечиваются, оставаясь красными. М. smagmatis под влиянием спирта эту краску теряют, но при докраске метиленовой синью становятся синими.

Приложение 3

Приложение 4

А) ОКРАСКА НУКЛЕОИДА БАКТЕРИЙ ЯДРОТРОПНЫМ

МЕТОДОМ ФЕЛЬГЕНА

Техника окраски :

1) Приготовить препарат из бактериальной культуры или дрожжей.

2) Высушить, зафиксировать в жидкости Карнуа 7 мин.

3) Промыть 80 % этанолом.

4) Обработать 1 N НСl, подогретой до 60⁰ С, в течение 7 мин, затем опустить препарат на 1-2 мин в холодную 1N HCl.

5) Обработать фуксинсернистой кислотой (реактив Шиффа) в течение 3-4 часов.

6) Промыть водой, высушить, микроскопировать с иммерсией.

Оценка результата. Ядерное вещество окрашено в фиолетовый цвет.

Б) ОКРАСКА НУКЛЕОИДА БАКТЕРИЙ ПО РОМАНОВСКОМУ – ГИМЗА

Техника окраски:

1) приготовленный препарат высушивают на воздухе;

2) фиксируют жидкостью Карнуа или смесью Никифорова;

3) фиксированные мазки подсушивают на воздухе и окрашивают рабочим раствором Романовского - Гимзы (к 10 мл дистиллированной воды добавляют 10 капель коммерческого красителя Романовского - Гимзы), погружая стекло в стаканчик с красителем.

4) Через 1 ч краситель сливают, и препарат промывают дистиллированной водой.

5) Готовый препарат высушивают на воздухе и микроскопируют.

Оценка результатов. Протоплазма форменных элементов ткани окрашивается в голубовато-синий цвет, ядра клеток - в фиолетово-красный, тела микробных клеток приобретают фиолетово-красный цвет.

Приложение 5

А) ВЫЯВЛЕНИЕ ЗЁРЕН ВОЛЮТИНА ПО НЕЙССЕРУ

Техника окраски:

1. Готовят мазок, высушивают, фиксируют жаром.

2. Наливают на мазок 1-2 капли уксуснокислого метиленового синего Нейссера, красят 1 - 2 минуты.

3. Краску сливают, наносят раствор Люголя на 1 мин.

4. Промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.

5. Наносят раствор везувина (хризоидина) для окраски тела бактерии на 1 – 3 мин.

6. Смывают водой, высушивают, микроскопируют.

Оценка результатов. В мазке цитоплазма бактерий окрашивается в жёлто-коричневый цвет, зёрна волютина - от сине-зелёного до сине-чёрного цвета.

Б) ВЫЯВЛЕНИЕ ЗЁРЕН ВОЛЮТИНА ПРОСТЫМ МЕТОДОМ ЛЕФФЛЕРА

Техника окраски:

1. Исследуемый материал наносят на чистые обезжиренные предметные стекла, растирают его тонким равномерным слоем по поверхности стекла, высушивают на воздухе.

2. Препарат фиксируют 3 мин в 96% этиловом спирте и высушивают.

3. На высушенный препарат наносят каплю 1% щелочного раствора метиленового синего по Леффлеру и окрашивают в течение 3 - 10 минут.

3. Промывают погружением в стакан с водопроводной водой.

4. Высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсионной системой.

Оценка результата . При правильном окрашивании в микроскопируемом препарате видны голубые бактерии на бесцветном или слабо голубом фоне.

Приложение 6

Приложение 7

Приложение 8

ВЫЯВЛЕНИЕ ЖГУТИКОВ У КУЛЬТУРЫ ПОДВИЖНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ МЕТОДОМ СЕРЕБРЕНИЯ ПО МОРОЗОВУ:

Техника окраски:

1) Прокаленной и охлажденной петлей слегка прикасаются к поверхности колоний или газонного роста микробной культуры, чтобы не вызвать механического повреждения жгутиков.

2) Полученный материал переносят в преципитационную пробирку, на дно которой налито 0,1 - 0,2 мл 1% раствора формалина. Петлю оставляют в неподвижном состоянии на несколько минут. За это время часть микробов переходит с петли в раствор. Эту процедуру повторяют 2-3 раза, пока жидкость не станет слабо опалесцировать.

3) Приготовленную взвесь ставят на 1 - 2 ч в термостат при 37⁰С для равномерного распределения микроорганизмов в жидкой среде.

4) Затем в пробирку с 1,5 - 2 мл дистиллированной воды вносят 1-2 капли формалиновой бактериальной взвеси. Через 10-15 мин, после того как бактерии относительно равномерно распределятся по всему объему жидкости, наносят 5-6 капель полученной взвеси на предметное стекло, не касаясь его петлей.

5) Капли высушивают на воздухе, не размазывая.

6) Для лучшего протравливания обрабатывают их реактивом № 1 (Реактив № 1: 1 мл ледяной уксусной кислоты. 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды) в течение 1 мин.

7) Остатки протравы сливают, мазок промывают водой.

8) После подсыхания мазка на препарат наливают реактив № 2 (Реактив № 2: 5 г танина, 1 мл жидкой карболовой кислоты, 100 мл дистиллированной воды), подогревают на лёгком пламени до появления паров (1 мин).

9) Тщательно промывают водой (1-2 мин).

10) На подсушенный после промывания препарат наносят реактив № 3 (Реактив № 3: 5 г кристаллического нитрата серебра растворяют в 100 мл дистиллированной воды, отливают 20 мл в другой сосуд, к оставшимся 80 мл раствора серебра по каплям добавляют раствор аммиака, пока не растворится образующийся осадок и не останется лёгкая опалесценция. Если аммиака будет слишком много, то из отлитых в другой сосуд 20 мл раствора серебра надо по каплям добавлять до получения нужной слабой опалесценции) и выдерживают его до появления тёмно- коричневой окраски мазка.

11) Тщательно промывают водой.

12) Высушивают и микроскопируют с иммерсионной системой.

Оценка результатов. Тела микробных клеток окрашиваются в коричневато-чёрный (угольно-черный) цвет, жгутики приобретают различные оттенки коричневого цвета и отчетливо видны на окрашенном в слабо-желтый цвет фоне.

Приложение 9

А) МЕТОД «РАЗДАВЛЕННОЙ КАПЛИ»

Техника приготовления:

1. На середину предметного стекла наносят 1 каплю бульонной культуры бактериологической петлей или стерильной пастеровской пипеткой. При её наличии на МПА вначале наносят каплю физиологического раствора и эмульгируют в ней 1 петлю микробов, взятых со среды.

2. Накрывают покровным стеклом, края которого смазаны вазелиновым маслом и, прижимают его к предметному так, чтобы не образовались пузырьки воздуха, и жидкость не вышла за края стекла. Капля «раздавливается» между ними. Стеклянной палочкой прижимают покровное стекло к предметному.

З. На покровное стекло наносят каплю иммерсионного масла и микроскопируют с объективом х90, окуляром х7 при слегка опущенном конденсоре.

В случаях работы с относительно крупными бактериями можно пользоваться сухими объективами х40 и даже х8 и обойтись без иммерсионного масла.

Б) МЕТОД «ВИСЯЧЕЙ КАПЛИ»

При определении подвижности бактерий выполняется по тому же принципу, но с различием в монтаже камеры.

Техника приготовления:

1. Берут покровное (не предметное), стекло, наносят на него 1 каплю исследуемой микробной взвеси.

2. Накрывают перевёрнутым предметным стеклом с луночкой, но с таким расчётом, чтобы капля оказалась в её центре. Для сцепления стёкол края лунки смазывают вазелиновым маслом. Предметное стекло слегка прижимают к покровному, в результате чего оба стекла склеиваются. После этого препарат переворачивают покровным стеклом кверху. Капля оказывается висячей над лункой. Получается герметически закрытая камера, в которой капля долго не высыхает.

З. Микроскопию проводят так же, как в предыдущем методе.

Оценка результата: неподвижные микробы в препаратах «раздавленной» и «висячей» капли создают картину броуновского движения, подвижные – проходят с одинаковой скоростью большие пространства, иногда через все поле зрения «вращаясь» вокруг своей оси.

Приложение 10

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОДВИЖНОСТИ БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ ПОСЕВА:

1. МЕТОД ШУКЕВИЧА:

Испытуемую культуру бактерий засевают в конденсационную воду косого МПА, не прикасаясь к его поверхности.

Ставят в термостат при +37С° на 18-24 часа.

Учёт результатов ведут по феномену роения, в процессе которого растущая культура ползёт по «косячку» вверх. Неподвижная культура развивается только в конденсате, а «косячок» МПА остаётся стерильным.

2. МЕТОД ПОСЕВА В СТОЛБИК ПОЛУЖИДКОЙ СРЕДЫ ПО ПЕШКОВУ:

Испытуемую культуру осторожно бактериальной петлёй засевают в столбик 1-1,5 % МПА.

Ставят в термостат при +37С° на 18-24 часа.

Учёт результатов производят по характеру роста: а) неподвижные бактерии растут строго по ходу укола; б) подвижные бактерии дают рост, напоминающий ёршик с расходящимися в стороны шипами. Оценка роста проводится визуально.

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ ПРЕПОДАВАТЕЛЕЙ

к практическому занятию № 2

Подвижности»

по программе дисциплины «Микробиология, вирусология»

по специальности - 31.05.01. «Лечебное дело» (уровень специалитета)

курс 2, семестр 4

Владивосток - 2016

- поставить диагноз, установить этиологию болезни;

- установить наличие и характер инфекционного заболевания;

- составить представление о возбудителе в исследуемом материале;

- изучить детали строения бактериальной клетки.

Цели занятия.

Научить:

- сложным способам окраски бактерий, их дифференциации;

- выявлению структурных элементов, в том числе защитных;

- функциональной оценке подвижности бактерий;

- анализировать информацию, полученную с помощью методов светооптической и других видов микроскопии (ОПК-9).

12 3 4 5 6 Следующая ⇒

Последнее изменение этой страницы: 2019-04-10; Просмотров: 663; Нарушение авторского права страницы