ПРИГОТОВЛЕНИЕ ВАТНЫХ ТАМПОНОВ,

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования

«Ивановская государственная сельскохозяйственная академия»

УДК 636.082.456(075.3)

В.Г. Турков

Учебно-методическое пособие по

ИСКУССТВЕННОму ОСЕМЕНЕНИю СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ

Рекомендовано Методической комиссией ФГОУ ВПО Ивановской ГСХА в качестве учебного пособия для студентов факультета ветеринарной медицины и биотехнологии в животноводстве, а также специалистов зооветеринарного профиля.

Иваново - 2005

Введение

Искусственное осеменение сельскохозяйственных животных является одним из выдающихся достижений XX столетия в области биологической науки. Использование этого открытия в практике разведения животных позволило планомерно осуществлять селекционную работу и получать практически неограниченное число потомков от выдающихся производителей. Эффективность искусственного осеменения подтверждают показатели возросшей продуктивности животных. Создание новых пород и гибридов животных, максимально адаптированных к природно-климатическим условиям, заложили новые направления в производстве продуктов питания и сырья. Благодаря искусственному осеменению удалось существенно сократить, а в ряде регионов полностью исключить заболевания животных рядом инфекций, возбудители которых передаются при контакте самок и самцов. Значительно снижены потери от бесплодия самок путем исключения из воспроизводства проблемных производителей. Практически во всех странах мира с развитым животноводством масштабы использования искусственного осеменения расширяются, а сама технология постоянно совершенствуется.

В настоящем учебно-методическом пособии по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных рассмотрены вопросы, связанные с получением спермы от производителей, ее оценкой, разбавлением и подготовкой к осеменению, введением спермы в половые пути самок. Освещены приемы организации отбора животных для осеменения, определения оптимальных сроков введения спермы, а также биотехнологические приемы организации искусственного осеменения.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАСТВОРОВ

ПОДГОТОВКА ИНСТРУМЕНТОВ И МАТЕРИАЛОВ

Приготовление растворов

Материал и оборудование: натрий двууглекислый, натрий лимоннокислый, натрий хлористый, фурацилин, спирт ректификат, цилиндры мерные, колбы стеклянные, весы с разновесом, вода дистиллированная, бумага фильтровальная, водяная баня.

Приготовление 0,9% раствора натрия хлорида

Мерным цилиндром отмеривают необходимое количество дистиллированной воды. Отвешивают химически чистый натрия хлорид из расчета 9 г на 1 л воды. Навеску натрия хлорида переносят в колбу с водой и доводят до кипения. Если натрия хлорид в таблетках по 0,9 г, то на 1 л воды берут 10 таблеток.

Раствор натрия хлорида применяют для увлажнения поверхности влагалищного зеркала, полиэтиленовых перчаток, удаления остатков спирта из шприцев-катетеров, спермоприемников, промывания посуды и инструментов. Срок хранения раствора не более суток.

Приготовление 1% раствора натрия двууглекислого

Дистиллированную воду кипятят и охлаждают до 40^оС. Отвешивают необходимое количество натрия двууглекислого из расчета 10 г на 1 л воды. Навеску высыпают в стерильную колбу и мерным цилиндром вносят необходимое количество теплой воды.

Раствор натрия двууглекислого применяют при оценке качества спермы, подготовке шприцев-катетеров, увлажнения поверхности инструментов. В работе используют только свежеприготовленный раствор.

Приготовление 2,9% раствора натрия лимоннокислого

Для приготовления раствора в чистую колбу наливают необходимое количество дистиллированной воды. Делают навеску натрия лимоннокислого из расчета 2,9 г сухого вещества на 100 мл воды. Раствор стерилизуют в кипящей водяной бане 10 минут.

Раствор натрия лимоннокислого применяют при оценке подвижности спермиев, подготовке инструментов. Для работы используют свежеприготовленный раствор.

Приготовление раствора фурацилина

Раствор фурацилина готовят на 0,9% растворе натрия хлорида. На 1 литр 0,9% раствора натрия хлорида делают навеску 0,2 г фурацилина. После внесения навески, раствор кипятят, охлаждают и фильтруют.

Используют раствор фурацилина для туалета наружных половых органов самок перед осеменением, промывания препуция у производителей, обеззараживания искусственных вагин после получения спермы. Приготовленный раствор хранят в затемненном месте в течение 2-х суток.

Приготовление 70% спирта

Для приготовления 100 мл 70% спирта, к 73 мл 96% спирта ректификата добавляют 27 мл прокипяченной дистиллированной воды и перемешивают. Приготовленный 70% спирт применяют для обеззараживания шприцев-катетеров, спермоприемников. Хранят спирт в банке с притертой крышкой.

МАРЛЕВЫХ САЛФЕТОК, ФИЛЬТРОВ

Материал и оборудование: гигроскопическая вата, марля, банки для тампонов, бикс для салфеток, фильтровальная бумага, воронки, ножницы.

Приготовление фильтров

Фильтр готовят из чистой фильтровальной бумаги. Бумагу разрезают ножницами на четырехугольные листы в соответствии с размерами воронки. Каждый лист перегибают по диагоналям. Раздвигают один слой бумаги малого треугольника и вкладывают фильтр в воронку. Концы фильтра обрезают так, чтобы при вкладывании его в воронку концы были ниже края воронки на 0,5 см.

Используют фильтры для фильтрования растворов.

ПОДГОТОВКА ПОСУДЫ И ИНСТРУМЕНТОВ

Вся посуда, используемая в технологии искусственного осеменения, делится на три категории: I – новая (не бывшая в употреблении), II – бывшая в употреблении (для приготовления растворов не содержащих протеино-липидных соединений), III - загрязненная (после растворов и сред содержащих белковые и жировые фракции или сразу не вымытая посуда второй категории).

Технология подготовки посуды

Категория посуды
I	II	III
1. Мытье со щет-кой и мылом (со-дой, стиральным порошком) 2. Замачивание в 1% растворе соля-ной кислоты (в течение 24 ч.) 3. Ополаскивание: а) в проточной воде, б) в дистиллиро-ванной воде (мно-гократно) 4. Сушка	1. Мытье в теплом 2-3% растворе двууглекислой соды 2. Ополаскивание: а) в проточной воде, б) в дистиллиро-ванной воде 3. Сушка	1. Замачивание в хромовой смеси (готовят из расчета: 60г дву-хромовокислого калия на 1л серной кислоты (хромпик), полученный раствор осторожно раз-водят в 10л воды). Посуда выдерживается в хромо-вой смеси в течение 24 ч. 2. Промывка в проточной воде. 3. Многократное ополас-кивание в дистиллиро-ванной воде 4. Сушка

Металлические инструменты (корнцанги, пинцеты и т.п.) моют теплым 2-3% раствором двууглекислой соды, ополаскивают кипяченой или дистиллированной водой и протирают насухо салфеткой или полотенцем. Затем посуду и инструменты подвергают стерилизации.

Стерилизация кипячением

Чистую стеклянную посуду и инструменты помещают в стерилизатор на слой ваты или марли, заливают дистиллированной водой и кипятят в течение 20 минут. Чистые металлические инструменты можно сразу помещать в кипящую воду. Простерилизованные инструменты извлекают пинцетом, удаляют капли воды с горячей поверхности стерильной салфеткой.

Стерилизация сухим жаром

Чистую посуду, инструменты для стерилизации помещают в электрический шкаф. Выдерживают при температуре 160-180°С в течение 2-х часов.

Стерилизация вазелина

В широкогорлую банку с притертой крышкой емкостью 100-150 мл накладывают вазелин и неплотно прикрывают (крышку лучше положить наклонно). В стерилизатор кладут вату или марлевую салфетку, на которую ставят банку с вазелином и наливают воду. Уровень воды в стерилизаторе должен быть не ниже уровня вазелина в банке. Стерилизуют вазелин в течение 30 минут с момента закипания воды в стерилизаторе. Банку с вазелином после окончания стерилизации извлекают. Крышку плотно закрывают после остывания вазелина.

Обеззараживание спиртом

Обеззараживание проводят 96% спиртом путем тщательного протирания поверхности инструментов тампоном, пропитанным спиртом.

КОНСТРУКЦИИ ИСКУССТВЕННЫХ ВАГИН ПОДГОТОВКА ИСКУССТВЕННЫХ ВАГИН

Подготовка искусственной вагины

К взятию спермы

Материал и оборудование. Искусственные вагины для взятия спермы быка, барана, хряка, жеребца; спермоприемники, штативы для вагин и спермоприемников, 2% раствор двууглекислой соды, ерши, поролоновые протирки, тазы, горячая вода, корнцанги, тампоны, спирт 96%, марлевые салфетки, кружки керамические на 250 и 500 мл, воронки стеклянные, резиновые груши, стерилизатор для вагин, шкаф-термостат.

Полноценное течение рефлекса эякуляции происходит в том случае, если в искусственной вагине созданы условия близкие к условиям влагалища самки в период стадии возбуждения.

Новые узлы искусственных вагин тщательно осматривают и моют в эмалированном тазу с помощью ерша или губки в 2% теплом растворе двууглекислой соды. Ополаскивают кипяченой водой и насухо вытирают чистым полотенцем или марлевой салфеткой.

В цилиндр (корпус) помещают резиновую камеру так, чтобы её гладкая поверхность была направлена в сторону просвета (внутрь). Ровно выходящие концы камеры натягивают на цилиндр и закрепляют резиновыми кольцами. В искусственных вагинах для взятия спермы от барана и жеребца дополнительная фиксация резиновой камеры не предусмотрена. Камера должна иметь умеренное натяжение и просвет без радиальных и поперечных складок. Собранная искусственная вагина не должна пропускать воду и воздух.

После сборки искусственную вагину моют в теплом 2% растворе двууглекислой соды. Ополаскивают и вытирают.

Перед стерилизацией оба конца искусственной вагины покрывают льняными колпаками или пергаментом. Лучший способ стерилизации - это автоклавирование в течение 30 минут при температуре 105^оС (0,5 атм). Искусственные вагины можно стерилизовать кипячением в течение 20 минут. В исключительных случаях применяют обеззараживание 96% спиртом-ректификатом.

Стеклянные спермоприемники подготавливают следующим образом: сначала моют в 2% растворе двууглекислой соды, ополаскивают кипяченой или дистиллированной водой, вытирают, обертывают бумагой и стерилизуют в автоклаве или сушильном шкафу (в течение 1 часа при температуре 180^оС).

После стерилизации в межстенное пространство вагины через отверстие в патрубке заливают воду и помещают в термостат на 24 часа. Температура в термостате для хранения искусственных вагин должна быть 44^оС, а для спермоприемников – 35^оС.

Если искусственные вагины используют сразу же после стерилизации, то в них заливают горячую воду. Объем воды и её температура представлены в таблице 1.

Температура во время взятия спермы внутри вагины должна быть 40-42^оС, а в спермоприемнике 25-30^оС. При выборе температуры внутри искусственной вагины необходимо учитывать индивидуальные особенности производителя.

Таблица 1

Объем воды и её температура для различных конструкций искусственных вагин

Производитель	Образец искусственной вагины	Объем воды (мл)	Температура воды (^оС)
Бык Баран Хряк Жеребец	Модель 1942 г. Модель 1960 г Укороченная Модель 1942 г Резиновая, Укороченная Алюминиевая	400 - 500 1200 - 1500 300 150 - 180 300 - 400 1500 - 2000	60 - 70 50 - 55 60 - 65 50 - 55 60 - 65 50 - 60

Перед взятием спермы, внутренней поверхности искусственной вагины придают скользкость стерильным вазелином или синтетической средой. Для этого с одного из концов вагины удаляют покрытие и стерильной стеклянной палочкой наносят вазелин или среду. Не смазанной оставляют не менее 1/4 длины камеры прилегающей к спермоприемнику (с целью исключения попадания их в спермоприемник при получении спермы).

После смазывания поверхности удаляют покрытие со второго конца и присоединяют спермоприемник.

Давление в искусственной вагине создается нагнетанием воздуха в межстенное пространство. Резиновой грушей (компрессором) нагнетают воздух до смыкания стенок на всем протяжении резиновой камеры. Давление в вагине обычно составляет 40-60 мм рт.ст. При создании давления учитывают индивидуальные особенности производителей.

В искусственных вагинах для получения спермы от быка (образца 1960 года, с балонообразным расширением) и жеребца, необходимое давление создается водой и дополнительное нагнетание воздуха не предусмотрено.

Взятие спермы от быка

Взятие спермы от быка проводят в манеже, который тщательно моют и дезинфицируют 2% раствором хлорамина. Перед работой манеж облучают ультрафиолетовыми лампами, пол и стены увлажняют слабыми дезинфицирующими растворами (0,02% раствор фурацилина, 0,01% раствор фуразолидона, 0,2% раствор хлорамина). Для взятия спермы от производителя используют быка-партнера или механическое устройство (рис. 7). Быка-партнера перед фиксацией в станке чистят, загрязненные места моют, волосяной покров увлажняют 0,2% раствором хлорамина. Одновременно проводят тщательную санитарную обработку производителя, от которого берут сперму.

К взятию спермы приступают не ранее чем через 2 часа после кормления. Предшествует взятию спермы получасовой моцион.

Для получения спермы искусственную вагину держат в правой руке. Как только бык начнет подниматься при хорошо выраженной эрекции полового члена, следует быстро подойти к нему справа, держа вагину под углом 35-45° спермоприемником вверх. Левой рукой, осторожно удерживая за препуций, отводят половой член немного в сторону и направляют в отверстие искусственной вагины. Продольная ось искусственной вагины должна совпадать с направлением полового члена при садке быка. Нельзя прикасаться рукой к слизистой оболочке полового члена, брать рукой за препуций до наступления эрекции, надевать искусственную вагину на половой член. Несоблюдение этих условий нарушает рефлекс эякуляции, а при повторении – приводит к угнетению половых рефлексов.

После введения полового члена в искусственную вагину, следует характерное движение вперед - толчок, который сопровождается эякуляцией. Снимают искусственную вагину не сразу, а вместе со сползающим движением быка.

Отняв искусственную вагину, переворачивают её спермоприемником вниз, открывают кран и выпустив воздух дают сперме стечь в спермоприемник. При использовании одноразового спермоприемника герметизируют полученный эякулят путем термической сварки с помощью аппарата «Молния» и отрезают его по метке. Стеклянный спермоприемник отделяют в боксе и, закрыв стеклянной крышкой, передают в лабораторию. Искусственную вагину передают в моечную.

Обычно сперму от быка получают 2 раза подряд (дуплетная садка) с интервалом 5-10 минут. Каждый эякулят получают в отдельную вагину.

Получение спермы от быка с помощью

Взятие спермы от барана

Сперму от барана берут с использованием овцы, которую фиксируют в станке. Садка у барана происходит очень быстро, а потому техник должен быть готов к получению спермы. Во время прыжка барана, техник находится справа от зафиксированной овцы. Он садится на корточки и держит искусственную вагину на уровне таза овцы под углом 35-40° спермоприемником вверх. В момент прыжка необходимо быстро, но осторожно направить половой член барана в искусственную вагину придерживая его за препуций. Эякуляция у барана продолжается 1-2 секунды и сопровождается характерным толчком вперед. После этого искусственную вагину снимают с полового члена, переворачивают спермоприемником вниз и дают сперме стечь, для чего открывают кран и выпускают воздух. Осторожно отделяют спермоприемник со спермой и передают в лабораторию.

Взятие спермы от хряка

Взятие спермы от хряка происходит на чучеле (рис. 8). Для выработки обнимательного рефлекса на чучело, хряков приходится приучать. С этой целью чучело покрывают шкурой свиноматки, мажут её течковой слизью.

Подготовленную искусственную вагину помещают в гнездо чучела. При входе в манеж хряк вначале обнюхивает чучело, а затем делает садку. В это время можно осторожно через кожу препуция направить половой член в искусственную вагину. Во время эякуляции хряк успокаивается, прекращает совокупительные движения, хвост обычно закручивается вверх и становится неподвижным, заметны ритмичные сокращения ануса, семенники подтягиваются кверху. В конце эякуляции наблюдаются ритмические сокращения хвоста, после чего производитель опускается с чучела. Если при получении спермы хряк проявляет признаки беспокойства, покидает чучело, это чаще свидетельствует о понижении температуры в искусственной вагине или уменьшение давления.

После получения спермы искусственную вагину извлекают из чучела, отделяют спермоприемник, закрывают его салфеткой и передают в лабораторию.

Взятие спермы от жеребца

Сперму от жеребца берут на кобылу в охоте. С целью безопасности на нее надевают случную шлейку. Хвост бинтуют от репицы до половины. Техник с искусственной вагиной находится с правой стороны в 5-6 метрах от кобылы. Когда жеребец сделает прыжок необходимо быстро подойти и удерживая вагину правой рукой прижать её к боку кобылы, а левой рукой направить половой член в отверстие вагины.

Во время садки жеребца техник правой рукой делает упор в спермоприемник, чтобы при энергичных толчках искусственная вагина прочно удерживалась на одном месте. Во время выделения спермы происходит ритмичное сокращение корня хвоста. В конце эякуляции эрекция полового члена ослабевает и жеребец медленно опускается с кобылы. После полного опускания жеребца искусственная вагина отделяется от полового члена и удерживается спермоприемником вниз. Спермоприемник снимают и передают в лабораторию.

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЭЯКУЛЯТА

Объем

Объем эякулята быка и барана определяют с помощью градуированного спермоприемника, пробирки, а эякулят жеребца и хряка - мензуркой или мерным цилиндром. Объем эякулята в одноразовом спермоприемнике определяют путем взвешивания. Масса 1 г спермы соответствуют 1 мл.

Таблица 2

Объем эякулята производителей сельскохозяйственных животных

Производитель	Объем эякулята ( мл)
Производитель	В среднем	колебание
Баран Бык Хряк Жеребец	1 - 1, 5 4 - 5 250 60 - 80	0, 5 - 3,0 1 - 15 100 - 1000 20 - 200

Если производитель выделяет слишком мало спермы это свидетельствует не только о нарушении рефлекса эякуляции, но и о серьезных погрешностях в кормлении, содержании, эксплуатации.

Цвет

Сперму осматривают при хорошем освещении. У быка и барана нормальная сперма белого цвета с желтоватым оттенком. У хряка и жеребца - молочно-белая с сероватым оттенком.

Розовый и красный цвет спермы означает, что в нее попала кровь. Зеленоватый цвет указывает на наличие гноя. Интенсивно желтое окрашивание отмечается при попадании мочи.

Консистенция

Нормальная сперма барана имеет сметанообразную консистенцию, быка - сливкообразную, у хряка и жеребца - водянистую. Консистенция должна быть однородной. Наличие хлопьев, примесей свидетельствует о низком качестве спермы.

Запах

Нормальная сперма не имеет особого запаха. Иногда сперма быка может иметь слабый запах парного молока, а барана - жиропота.

Наличие гнилостного запаха указывает на патологические процессы в половых органах производителя.

Если внешние признаки эякулята имеют отклонение от нормальных показателей, то такую сперму бракуют и для работы не используют. Производитель должен быть всесторонне исследован и подвергнут соответствующему лечению. Ему необходимо создать особый режим содержания и использования.

Определение густоты спермы

Густота спермы зависит от количества спермиев в эякуляте и степени разбавления спермы секретами придаточных половых желез. Оценку густоты проводят под микроскопом в раздавленной капле.

Подготовка микроскопа к работе. На малом увеличении (объектив 8, окуляр 15) устанавливают равномерное освещение поля зрения.

Спермии лучше просматривать в неярком свете. Для этого прикрывают диафрагму и опускают конденсор микроскопа. На предметный столик микроскопа помещают термостолик или обогревательный столик Морозова. В обогревательный столик предварительно наливают горячую воду (60-65^оС). Через боковое отверстие в обогревательном столике измеряют температуру. К моменту оценки она должна составлять 40-42^оС.

Приготовление препарата. На чистое обезжиренное предметное стекло стеклянной палочкой или пипеткой наносят каплю исследуемой спермы и накрывают покровным стеклом, таким образом, чтобы под стеклом не образовались пузырьки воздуха.

Свежеполученная сперма очень чувствительна к температурным колебаниям. Чтобы не допустить температурного шока спермиев, предметное стекло должно быть теплым, а температура воздуха в лаборатории не менее 20ºС. Оценку густоты проводят при увеличении 180-300 раз.

В зависимости от насыщенности спермиями, неразбавленная сперма может иметь следующие оценки: густая (Г), средняя (С), редкая (Р) (рис. 9 а,б,в).

Сперму считают густой, когда все поле зрения микроскопа заполнено спермиями. Между отдельными спермиями почти не видно промежутков. В густой сперме трудно различить движение отдельных спермиев.

Средняя сперма - в поле зрения заметны промежутки между спермиями, хорошо различимо движение отдельных спермиев.

Редкая сперма - спермии размещены в поле зрения микроскопа так, что между отдельными спермиями имеются промежутки, значительно больше размера самих спермиев.

Неразбавленная сперма производителей сельскохозяйственных животных в зависимости от густоты содержит в 1 мл следующее количество спермиев:

Производитель	Концентрация спермиев (млрд./мл)
Производитель	густая (Г)	средняя (С)	редкая (Р)
Баран Бык Хряк Жеребец	> 2 > 1 > 0,2 > 0,25	1 – 2 0,6 - 1 0,1 - 0,2 0,15 - 0,25	< 1 < 0,6 < 0,1 < 0,15

Олигоспермия - слишком малое количество спермиев в эякуляте.

Аспермия - отсутствие спермиев в сперме.

К использованию допускается: сперма барана - только густая, сперма быка, хряка, жеребца - густая и средняя.

По стандартам

Материал и оборудование: сперма, стандарты.

Стандарты представляют собой стеклянные запаянные пробирки одинакового диаметра с жидкостью имитирующей сперму жеребца разной концентрации: 10 - 20 - 200 - 300 и 500 млн. спермиев в 1 мл.

Сперму наливают в прилагаемую пустую пробирку такого же диаметра и сравнивают со стандартом. Стандарты, предварительно встряхивают, чтобы осадок равномерно размешался. Пробирки просматривают на свет, при этом подбирают стандарт, наиболее близкий по густоте к определяемой сперме, который и принимают за ее концентрацию. Концентрация спермиев может быть определена и как промежуточная между двумя стандартами.

При концентрации более 500 млн. спермиев в 1 мл сперму можно разбавлять 7% раствором глюкозы в 2 раза (1:1), затем установить концентрацию по стандартам и сделать соответствующий пересчет на неразбавленную сперму.

Для большей точности определения к сравниваемым пробиркам сзади вплотную прикладывают стеклянную палочку.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСМОТИЧЕСКОЙ

РЕЗИСТЕНТНОСТИ СПЕРМИЕВ

Материал и оборудование: флаконы из-под пенициллина с резиновыми пробками, раствор натрия хлорида различной концентрации: 0,1; 0,15; 0,2; 0,25; 0,3; 0.35; 0.4; 0,5; 0,6%, термостат, микропипетки, мерные пипетки, термостолики, предметные и покровные стекла, стеклянные палочки.

Определение осмотической резистентности (Ро) основано на устойчивости спермиев к гипотоническим растворам натрия хлорида. Осмотическую резистентность спермиев определяют как в свежеполученной, так и разбавленной сперме, а так же сохраненной при плюсовой температуре и в заморожено-оттаянной сперме. Этот показатель позволяет судить о биологических свойствах спермиев защитной способности сред. При определении осмотической резистентности спермиев в эякуляте соблюдают правила, предупреждающие холодовой шок спермиев. Лабораторную посуду и растворы подогревают до 30-35°С.

Для испытания готовят ряд из 9 флаконов, содержащих по 1 мл раствора натрия хлорида различной концентрации. Флаконы с растворами закрывают резиновыми пробками и ставят в термостат при 30-37^оС на 10-15 минут. В каждый флакон вносят по 0,01 мл спермы быка. Флаконы с разбавленной спермой выдерживают 3 часа при температуре 18-22^оС и определяют подвижность спермиев.

За резистентность принимают значение концентрации раствора натрия хлорида того флакона, в котором спермии сохранили подвижность не ниже 0,5 балла. Чем ниже концентрация раствора, тем выше осмотическая резистентность. Минимальная осмотическая резистентность – 0,6. При гибели спермиев в 0,6% растворе считают, что Ро = 0.

При определении качества спермы по Ро лучше пользоваться коэффициентом резистентности (Рк), который вычисляют по формуле:

, где:

0,1 - постоянный коэффициент;

Ро - осмотическая резистентность.

Наивысший показатель Рк = 1.

Сперму быка в зависимости от Рк делят по качеству на четыре категории: высшего качества – 0,5-1,0;

хорошего качества – 0,26-0,49;

удовлетворительного – 0,21-0,25;

неудовлетворительного – 0,2 и ниже.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АБСОЛЮТНОЙ

ВЫЖИВАЕМОСТИ СПЕРМИЕВ

Материал и оборудование: сперма, микроскопы, обогревательные столики, сухие стерильные пробирки с пробками на 2 мл, стерильные мерные пипетки (1-2 см³), штатив, синтетический разбавитель, термос со льдом, стерильные стеклянные палочки, предметные и покровные стекла.

Под выживаемостью спермиев подразумевают продолжительность их жизни вне организма в определенных условиях. Это важный показатель качества спермы, поскольку он дает возможность предсказать оплодотворяющую способность спермы. Выживаемость спермиев выражается абсолютной выживаемостью (S).

Для определения абсолютного показателя выживаемости спермиев берут 11 стерильных пробирок емкостью по 2 мл и нумеруют восковым карандашом. Во все пробирки, за исключением первой, наливают по 0,5 мл синтетической среды. В первую и вторую пробирки вносят по 0,5 мл неразбавленной спермы. Первая пробирка в дальнейшем служит контролем.

Сперму во второй пробирке тщательно перемешивают со средой путем пипетирования и из нее переносят 0,5 мл в третью пробирку; в третьей пробирке смесь перемешивают и переносят в четвертую и т.д. Из последней пробирки (11-ой) 0,5 мл смеси выливают. Таким образом, в первой пробирке сперма не разбавленная, а в пробирках со 2 по 11-ую сперма разбавлена в 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256, 512, 1024 раза.

Из каждой пробирки на теплое предметное стекло берут каплю спермы и оценивают подвижность. Пробирки устанавливают в штатив, закрывают стерильными пробками и ставят на хранение в термос со льдом.

В последующем ежедневно оценивают подвижность спермиев под микроскопом при температуре 40°С. Оценку подвижности проводят до установления гибели всех спермиев во всех пробирках. Результаты исследований заносят в таблицу. Показатель абсолютной выживаемости (S) определяют по формуле:

S = а ₁ t ₁ + а ₂ t ₂ + а ₃ t ₃ . . . а _n t _n, где:

а ₁а ₂а ₃ ... а _n - подвижность спермиев за интервалы времени, в баллах;

t ₁ t ₂ t ₃ ... t _n - последовательные интервалы времени, в часах.

Интервалы времени в часах вычисляют по формуле:

, где:

T _n + 1 - время в часах от начала опыта до последующего определения подвижности;

T _n - 1 - время в часах от начала опыта до предыдущего определения подвижности.

Хорошая сперма быка и барана, разбавленная синтетической средой в 16-32 раза, должна иметь показатель абсолютной выживаемости спермиев не ниже 1400, хряка - 900, жеребца - 400 и выше.

Определение коли-титра

Материал и оборудование: разбавленная сперма (1:10, 1:100, 1:1000), стерильные пипетки, среда Бумера, термостат, среда Эндо.

Из каждого разбавления спермы делают стерильной пипеткой посевы (по 1 см³) в среду Бумера. Посевы инкубируют в течение 18-24 часов при температуре ± 43-44^оС.

При росте кишечной палочки среда становится желтой и мутной, и в бродильной трубке накапливается газ. Из таких пробирок делают посевы на среду Эндо. Эти посевы инкубируют в термостате в течение суток. Если выросли колонии микробов с характерным ростом колоний кишечной палочки (ярко красный цвет), тогда делают мазки и окрашивают по Граму.

Пригодными к применению считают эякуляты быка, коли-титр которых не более 1:10.

Действие антисептиков

В свежеполученной сперме определяют подвижность. Затем к капле спермы нанесенной на предметное стекло добавляют каплю антисептика (раствор калия перманганата 1:3000, 2% раствор формалина, 96% спирт). После смешивания спермы с каплей антисептика препарат накрывают покровным стеклом и под микроскопом наблюдают. Через сколько минут наступает гибель спермиев. Если вокруг капли со спермой нанести в виде кольца 5% раствор йода, то йод улетучиваясь будет окрашивать сперму в желтый цвет. Под микроскопом можно отмечать массовую гибель спермиев от паров йода.

Таблица 9

ПОДГОТОВКА ГЛУБОКОЗАМОРОЖЕННОЙ СПЕРМЫ К ОСЕМЕНЕНИЮ

Материал и оборудование: глубокозамороженная сперма, водяная баня (биологический термостат, оттаиватель), микроскопы, термостолики, предметные и покровные стекла, 2,9% раствор натрия лимоннокислого, термометр, пипетки, корнцанг, пинцет, тампоны спиртовые, салфетки.

Оттаивание глубокозамороженной спермы в различной расфасовке - в необлицованных гранулах, соломинках (пайэтах), облицованных гранулах (капсулах, пилеттах), пакетах, является ответственной операцией, которая требует определенных навыков и строгого выполнения целого ряда правил.

До начала оттаивания необходимо подготовить все инструменты, водяную баню (биологический термостат, оттаиватель спермы), микроскоп с термостоликом к работе.

Температура воды в водяной бане (биологическом термостате) должна быть в пределах 40-42°С.

Объемом 0,1- 0,2 мл

В гнездо штатива помещают простерилизованный флакон или ампулу с 2,9% раствором натрия лимоннокислого (1 мл). Ампулу предварительно вскрывают, исключая при этом попадание стекла внутрь. Вскрыть ампулу необходимо в расширенной части, для обеспечения свободного прохождения гранулы. Выдерживают флакон (ампулу) с раствором натрия лимоннокислого в водяной бане не менее 3-х минут при температуре 40-42°С.

Стерильный корнцанг или пинцет вносят в горловину сосуда Дьюара и охлаждают в парах азота. Охлажденным корнцангом или пинцетом берут гранулу из канистры (тубы, контейнера) и быстро переносят в подготовленный для оттаивания флакон или ампулу. Не вынимая из воды, круговыми движениями покачивают флакон или ампулу до полного растворения гранулы. Процесс таяния обычно продолжается 7-8 секунд. После этого флакон (ампулу) со спермой вынимают из воды и ставят на стол. Температура в помещении лаборатории должна быть не менее +20°С.

Нельзя помещать при оттаивании во флакон (ампулу) больше одной гранулы.

Оценивают подвижность спермиев под микроскопом в раздавленной капле.

Оттаивание гранул спермы объемом 0,5 мл

Для осеменения коров и телок может поступать сперма замороженная в гранулах объемом 0,5 мл, не требующая при оттаивании дополнительного внесения 2,9% раствора натрия лимоннокислого. Для оттаивания такой спермы необходимо стерильным, предварительно охлажденным пинцетом или корнцангом взять из сосуда Дьюара две гранулы (доза спермы) и поместить их в стерильный стеклянный флакон, подогретый на водяной бане (биологическом термостате) до 40-42°С. Флакон с гранулами, не вынимая из воды осторожно вращают круговыми движениями до полного таяния гранул, после чего флакон переносят на лабораторный стол при комнатной температуре (не менее +20°С).

Время таяния двух гранул объемом 0,5 мл составляет 1,5-2 минуты.

Нельзя в один флакон помещать более двух гранул.

Оттаивание спермы, замороженной в соломинках (пайэтах)

В термосе или биологическом термостате, где проводят оттаивание спермы, замороженной в пайэтах, температура воды должна быть равна 38 ± 0,5°С. Операцию по оттаиванию спермы осуществляют следующим образом: правой рукой открывают крышку сосуда Дьюара, а левой – до горловины сосуда поднимают пластмассовый стакан со спермой. Затем правой рукой берут специальные ножницы или пинцет и концы инструмента охлаждают в жидком азоте. Охлажденным инструментом вынимают одну соломинку и быстро стряхивают с нее остатки азота и переносят в воду для оттаивания.

Соломинки помещают в воду заводской пробиркой вниз, а лабораторной вверх. Стакан с соломинками опускают на дно сосуда Дьюара, сосуд закрывают крышкой. В течение 10-11 секунд. температура в соломинках повышается до 0°С. Затем соломинку вынимают, удаляют салфеткой капли воды.

Одновременно можно проводить оттаивание не более двух доз спермы при условии немедленного использования.

Оценивают подвижность спермиев по общепринятой методике.

СПОСОБЫ ВВЕДЕНИЯ СПЕРМЫ

В ПОЛОВЫЕ ПУТИ САМОК

Крупного рогатого скота

Биотехнологическая регуляция полового цикла основана на закономерностях течения физиологических процессов в организме животного. Целенаправленное воздействие на половой цикл позволяет проводить искусственное осеменение коров и телок в наиболее оптимальные сроки, иметь высокие показатели оплодотворяемости, получать приплод в запланированный период, эффективно профилактировать возможные отклонения в эндокринной регуляции половой функции.

Биотехнологическая система программированного размножения включает последовательное выполнение следующих этапов:

1. Формирование группы животных (коров, телок), подлежащих осеменению. Оптимальная группа состоит из 15-30 животных. Для воспроизводства отбирают здоровых коров, которые имеют послеотельный период не менее 40 дней. Телок используют при достижении ими физиологической зрелости. Животные должны иметь хорошую упитанность. В группу включают животных с активной функцией желтых тел в яичниках. Функциональная активность яичников оценивается ректальной пальпацией. Яичник, содержащий активно функционирующее желтое тело обычно в 1,5-2 раза больше противоположного. При периферическом расположении желтого тела он приобретает овальную форму с утолщением в месте локализации желтого тела, при центральном положении желтого тела в яичнике, последний становится округлым. Во всех случаях над желтым телом расположено небольшое возвышение, которое влияет на форму яичника. Желтое тело 1,5-2 см в диаметре, ткани его упруго-уплотненной консистенции, границы желтого тела хорошо конструированы и отличаются от окружающей податливой ткани яичника, в которой могут быть мелкие очаги уплотнений.

2. Индукция стадии возбуждения проводится применением клопростенола в дозе 500 мкг, однократно, внутримышечно. Препарат инъецируют отобранным животным в день формирования группы.

3. Синхронизация (индукция) овуляции выполняется препаратом ГнРГ (сурфагон) в дозе 20 мкг, препарат применяется однократно, внутримышечно, через 72 часа после применения клопростенола.

4. Искусственное осеменение животных выполняется цервикальным способом с ректальной фиксацией шейки матки. Осеменение может быть проведено двукратно или однократно. Двукратное осеменение обеспечивает более высокую оплодотворяемость, но связано с использованием двух доз спермы. Первое осеменение выполняют через 72 часа после применения клопростенола, второе - через 90 часов. При однократном осеменении сперму вводят через 84...86 часов после применения клопростенола.

5. Ранняя клиническая диагностика беременности выполняется через три недели после осеменения. Ранняя клиническая диагностика беременности основана на определении функционального состояния яичников и учете признаков стадии возбуждения полового цикла.

6. Повторное осеменение неоплодотворившихся животных может быть выполнено сразу же после проведения ранней клинической диагностики беременности при наличии комплекса признаков стадии возбуждения полового цикла.

7. Заключительная клиническая диагностика беременности по изменениям в матке проводится через 50-60 дней после осеменения.

8. Подготовка животных к отелу и проведение родов выполняется согласно известных рекомендаций.

Управляемое воспроизводство планируют исходя из конкретных задач и хозяйственных условий.