Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


ПРИБОРЫ ДЛЯ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ



Одной из основных задач в развитии хроматографического приборостроения является расширение разработок и выпуска жидкостных хроматографов при дальнейшем их совершенствовании. В настоящее время более 100 фирм во всём мире серийно производят жидкостные хроматографы, поскольку значительно расширился рынок сбыта данных приборов за счёт применения их в медицине, судебной медицине, в химической и фармацевтической промышленности, биотехнологии и для охраны окружающей среды.

Отличие жидкостного хроматографа от газового состоит в применении в качестве подвижных фаз различных жидких растворителей и их смесей. В связи с высокой плотностью элюента и соответственно большими сопротивлениями колонок в жидкостном хроматографе, хроматографические приборы для газовой и жидкостной хроматографии сильно различаются по аппаратурному оформлению.

 

НАСОСЫ

Для создания потока чистого растворителя или смеси растворителей (элюента) используют насосы, входящие в гидравлическую схему хроматографа.

Гидравлическая линия любого современного жидкостного хроматографа, блок-схема которого приведена рис. 22, в простейшем случае состоит из насоса, колонки и детектора.

 

Рис. 20. Схема высокоэффективного жидкостного хроматографа:

1,2 - насосы; 3 - дозатор; 4 - предколонка; 5 - колонка; 6 - термостат колонки; 7 - детектор; 8 = коллектор фракций; 9 - блок управления коллектором; 10 - интегратор; 11 - регистратор; 12 - блок регулирования температуры; 13 - микропроцессор; 14 - блок автоматики ввода пробы; 15 - блок управления градиентного элюирования; 16, 17 - резервуары с растворителем. Сплошная линия - электрический кабель, пунктирная - поток растворителя.

 

Основное назначение насосов состоит в создании стабильного установленного потока элюента в определённом диапазоне расходов и обеспечении давления, необходимого для пропускания элюента при этом расходе через колонку. Для уменьшения уровня флуктуационных шумов детекторов насосные системы должны обеспечивать стабильный и без пульсаций расход. Диапазон расходов должен быть пригоден для любого метода жидкостной хроматографии и составлять 0.01-100 мл/мин. С помощью насосов могут быть созданы два принципиально различных режима работы: изократический, характеризующийся постоянством состава подвижной фазы во время анализа, и градиентный, в котором состав (элюента) меняется во время анализа по заданной программе.

Имеются два принципиально различных типа насосов: постоянного давления и постоянного расхода. Насосы первого типа поддерживают установленное постоянное давление на входе в колонку, а расход определяется её сопротивлением. Насосы второго типа поддерживают постоянный расход элюента, а давление на входе в колонку определяется её сопротивлением.

Основные характеристики насосов: максимальное давление, диапазон расходов, стабильность поддержания расхода и давления, инертность по отношению к элюенту и пробе, простота сборки и разборки.

Для работы на современных аналитических колонках длиной 50-250 мм и внутренним диаметром 2-10 мм, заполненных сорбентом с диаметром частиц 5-15мкм, при применении растворителей средней вязкости и при комнатной температуре требуется давление элюента от 0.5 до 30 Мпа. При использовании сорбентов с диаметром частиц менее 3 мкм и колонок длиной более 300 мм может потребоваться создание более высоких давлений, например до 50-70 МПа.

Стабильность поддержания расхода с погрешностью менее 1% во всём диапазоне расходов позволяет использовать большинство из наиболее распространённых и выпускающихся серийно детекторов. Стабильность потока элюента непосредственно влияет на погрешность и воспроизводимость результатов анализа, а также на уровень флуктуационных шумов нулевого сигнала некоторых типов детекторов.

С целью сглаживания пульсаций применяют демпфирующие устройства, многоголовочные системы поршневых насосов, микропроцессорный контроль пульсаций. Так как насосы в жидкостной хроматографии должны работать с любыми элюентами при рН=3-10, в том числе с кислотами, растворами солей, агрессивными органическими жидкостями, высокие требования предъявляются к конструкционным материалам насосов. Наилучший материал для корпуса насоса – это титан и его сплавы с палладием и цирконием. Допускается использование аустенитной нержавеющей стали или стали марки 12Х18Н-10Т.

Для плунжеров и шариковых клапанов наилучшими материалами являются лейкосапфир и рубин. Сальники обычно изготавливаются фторопласта или полиамида, причем последний предпочтительнее. Детали насосной системы, контактирующие с элюентом, должны соединяться переходниками из тех же материалов, из которых изготовлен насос. Применение сварки и пайки не допускается. В связи с непрерывной работой в тяжелых условиях некоторые детали насоса быстро изнашиваются, корродируют, загрязняются. При этом необходима разборка насоса и замена или чистка этих деталей. Поэтому легкость разборки насоса является одной из определяющих его характеристик.

К насосам постоянного давления относят насосы, в которых применяют сжатый газ и насосы с пневмогидравлическим усилителем. На рис. 23 представлена схема насоса, в котором элюент из резервуара 5 через трехходовые краны 4 и 8 предварительно заполняют элюентом длинную спиральную трубку 7 из нержавеющей стали вместимостью около 500 см3. После заполнения трубку подключают к баллону 1 с газом; с помощью редуктора 2 и образцового манометра 3 устанавливают требуемое давление на входе в колонку 9. Диффузия газа на заднем фронте элюента незначительна в трубке небольшого диаметра. Насосы обычно используют при давлениях не выше 5 МПа, так как стандартное давление в газовых баллонах не более 15 МПа.

 

  Рис. 23. Газовый насос для жидкостного хроматографа: 1 -баллон с газом; 2 - редуктор; 3 - манометр; 4,8 - трехходовые краны: 5 - резервуар с растворителем; 6 - дренаж; 7 - трубка; 9 - подача элюента в колонку   Рис. 24. Пневмогидравлический насос: 1,2 - вход и выход сжатого газа при работе и заполнении насоса; 3,4,12 - кольцевые уплотнения; 5 - выход элюента; 6 - клапан нагнетания; 7 - клапан всасывания; 8 - вход элюента из резервуара; 9 - гидравлическая камера насоса; 10 - плунжер; 11 - поршень; 13 - пневматическая камера

 

Газовые насосы не имеют движущихся частей, работают надежно и перезаполняются достаточно легко. Недостатками являются относительно невысокое давление и сложность замены растворителей, связанная с промывкой коммуникаций.

Схема пневмогидравлического насоса приведена на рис. 24. Давление жидкости, создаваемое плунжером, пропорционально давлению на поршень и зависит от отношения сечений поршня и плунжера. Предел отклонения расхода элюента от среднего значения составляет ± 5%. Расход элюента зависит от заданного входного давления воздуха и сопротивления колонки, которое в свою очередь зависит от размера частиц сорбента, степени их уплотнения и вязкости элюента. Объём элюента в рабочей камере насоса в среднем составляет от 20 до 60 см3. Регулировка потока достаточно проста. Поток можно мгновенно остановить. При повторном пуске давление быстро восстанавливается.

К насосам постоянного расхода относят шприцевые, поршневые и мембранные насосы.

Схема шприцевого насоса, который применяют, например, в хроматографе «Милихром», показана на рис. 25.

 

 

 

Рис. 25. Шприцевой насос хроматографа “Милихром”:

1 - емкость с элюентом; 2 - трехходовой кран; 3 - поток элюента; 4 - крышка с насоса; 5 - прокладка; 6 - поршень; 7 - цилиндр; 8 - шток; 9 = шарик, 10,11 - червячная передача; 12 - двигатель

 

С помощью червячной передачи 10-11 от шагового двигателя 12 шток 8 с поршнем 6 движется в калиброванной стеклянной трубке 7, сжимая элюент и пропуская его через трёхходовой кран 2 в колонку. При заполнении шприца кран 2 поворачивают в положение, показанное на рисунке пунктиром, а чистый элюент из емкости 1 засасывается в шприц при обратном ходе штока 8, при этом вращение шагового двигателя меняется на противоположное. Полный объём шприца около 2.5 см3, максимальное давление не более 5 МПа, точность подачи элюента около 1%. Насос применяют для обеспечения работы колонок внутренним диаметром 2 мм и длиной менее 100 мм. Шаговый двигатель позволяет получать различные скорости перемещения штока. Расход элюента можно менять от 2 до 600 мкл/мин.

Один шприцевой насос может быть использован для создания ступенчатого градиента путём применения специальной программы его заполнения. Два шприцевых насоса легко приспособить для получения градиента путём программируемого увеличения расхода элюента первым насосом и пропорционального уменьшения другого элюента вторым насосом.

Существенным недостатком насоса является невозможность коррекции на сжимаемость растворителей. Для давлений менее 5 МПа этот недостаток не столь существен. Однако при давлении в колонке более 20 МПа сжимаемость элюентов составляет более 1 %. При этом наблюдается значительная задержка в достижении установленного значения расхода потока элюента при включении насоса. Такая задержка нежелательна при вводе пробы методам остановки потока.

Схема насоса возвратно-поступательного типа с одним плунжером приведена нарис. 26. Принцип действия насоса основан на вытеснении определённого объёма жидкости из камеры 4 с помощью плунжера 3, который приводится в действие с помощью эксцентрика 1, подсоединённого к двигателю насоса. Насос на входе 8 и выходе 5 имеет обратные шариковые клапаны 6 и 7. Шарики и сёдла для них обычно изготавливают из нержавеющей стали, сапфира или рубина. Для надёжной работы таких клапанов необходимо полное отсутствие в элюенте твёрдых взвешенных частиц. Твёрдые частицы устраняют с помощью пористых фильтров из нержавеющей стали или титана с размером пор от 1 до 5 мкм.

Одной из модификаций одноплунжерного насоса является диафрагменный насос (рис. 27). Давление, создаваемое плунжером 2 в промежуточной камере 10 насоса, заполненной инертной малолетучей жидкостью, передаётся на диафрагму 7, которая вытесняет растворитель через обратный клапан. Преимущество мембранного насоса – отсутствие контакта элюента с движущимся плунжером, меньшее загрязнение плунжера и камеры и, соответственно, большая надёжность и долговечность работы насоса. Наиболее слабыми местами поршневых насосов являются уплотнения плунжера и клапаны. Производительность насосов возвратно-поступательного типа зависит от длины рабочего хода плунжера. В связи с тем, что одна половина хода поршня используется для нагнетания, а другая для заполнения камеры насоса, одноплунжерный насос имеет значительную пульсацию на выходе. Поэтому для таких насосов чаще всего применяют демпферы для сглаживания пульсаций.

Одной из модификаций одноплунжерного насоса является диафрагменный насос (рис. 27). Давление, создаваемое плунжером 2 в промежуточной камере 10 насоса, заполненной инертной малолетучей жидкостью, передаётся на диафрагму 7, которая вытесняет растворитель через обратный клапан. Преимущество мембранного насоса – отсутствие контакта элюента с движущимся плунжером, меньшее загрязнение плунжера и камеры и, соответственно, большая надёжность и долговечность работы насоса. Наиболее слабыми местами поршневых насосов являются уплотнения плунжера и клапаны. Производительность насосов возвратно-поступательного типа зависит от длины рабочего хода плунжера. В связи с тем, что одна половина хода поршня используется для нагнетания, а другая для заполнения камеры насоса, одноплунжерный насос имеет значительную пульсацию на выходе. Поэтому для таких насосов чаще всего применяют демпферы для сглаживания пульсаций.

 

Рис. 26. Одноплунжерный возвратно-поступательный насос: 1 - эксцентрик; 2 - сальник; 6 - плунжер; 4 - камера с элюентом; 5, 8 - поток элюента; 6 - клапан нагнетания; 7 - клапан всасывания Рис. 27. Диафрагменный одноплунжерный насос: 1 - эксцентрик; 2 - плунжер; 3 - кольцевое уплотнение; 4 - обратный клапан; 5,9 - поток элюента; 6,8 - шариковоые клапаны; 7 - диафрагма; 10 - промежуточная камера

 

Систему узлов, состоящую из насоса, демпфера, аварийного клапана максимального давления, измерителя давления, резервуаров с растворителями и фильтров, обычно называют насосной системой или системой подачи элюента.

В новых конструкциях одноплунжерных насосов время заполнения камеры насоса (около 20 мс) значительно меньше времени рабочего хода плунжера. Поэтому за время возврата плунжера в исходное положение падение давления незначительное. Микропроцессорный контроль за работой шагового двигателя и плунжера позволяет компенсировать колебания потока во время заполнения и эффект сжимаемости растворителей. Для сглаживания пульсаций потока применяют двухплунжерные насосы со сдвигом работы плунжеров по фазе на 180 0 и трёхплунжерные насосы со сдвигом на 120 0.

На рис. 28 представлена схема двухплунжерного насоса, управляемого одним двигателем 2. Забор и нагнетание жидкости плунжерами 1 и 3 сдвинуты по фазе и синхронизированы. Пунктиром показана возможность подключения к системе третьей камеры.

В нашей стране разработан и запатентован за рубежом двухплунжерный насос (насосы Б. И. Баглая), в котором постепенное вытеснение жидкости из одной камеры сопровождается пропорциональным заполнением другой. Конструкция такого насоса предусматривает согласованное движение двух камер, изготовленных в одном корпусе, и одного из плунжеров, причём другой плунжер жёстко закреплён. Система обеспечивает достаточно высокую стабильность расхода потока и возможность коррекции на сжимаемость элюента. Необходимость применения демпфирующих устройств отпадает. Конструкции насосов возвратно-поступательных типов просты, обычно обеспечен свободный доступ к местам возможных течей, насосы легко разбираются и собираются с целью очистки и ремонта. Увеличение или уменьшение размеров камер и плунжеров путем их достаточно простой замены без изменения системы привода увеличивает или уменьшает производительность насосной системы и позволяет работать с полупрепаративными и микронасадочными колонками.

 

 

Рис. 28. Двухплунжерный насос возвратно-поступательного действия:

1,3 - плунжеры; 2 - привод двигателя; 4 - дополнительный плунжер; 5 - камера насоса;

6,8 - поток элюента; 7 - шариковые клапаны

 

В большинстве насосов возвратно-поступательного типа применяют шаговые двигатели, скорость которых легко контролируется электронной схемой управления. Появляется возможность достаточно простого программирования расхода потока элюента, т.е. применения системы градиентного элюирования. Эффект создания градиента в наиболее простом случае достигается путём контролируемого смешения двух растворителей разной полярности, причём в одних случаях полярность элюента увеличивается (адсорбционная ЖХ), а в других уменьшается (обращённо-фазовая ЖХ).

Используют две различные системы создания градиента: смешение при высоком давлении и смешение при низком давлении. Блок-схемы систем представлены на рис. 29.

Для смешения при высоком давлении (рис. 29, а) характерно применение отдельных насосов 5 и 6 для каждого типа растворителя 2 и 3 и их смешения в камере 7 на выходе насосов. Смесительная камера должна обеспечивать полное перемешивание растворителей. Насосы управляются по определённой программе, заложенной в устройство программирования или микропроцессор 1. Для смешении при низком давлении (рис. 29, б), растворители из резервуаров 2-4 засасываются насосом 5 через регулируемые электромагнитные клапаны 9 в смесительную камеру 7, из которой смесь растворителей поступает в дозатор и колонку жидкостного хроматографа. Работу клапанов обычно контролируют микропроцессором 1.

Рис. 29. Структурные схемы систем градиентного элюирования с одним насосом (а) и с двумя насосами:

! - микропроцессор; 2-4 - емкости с растворителем; 5,6 - насосы; 7 -камера смешения; 8 - поток элюента; 9 - электромагнитные клапаны. Сплошная линия - элюент; пунктирная - - электрический кабель

Преимуществом последней системы является применение только одного насоса, что даёт возможность градиентного элюирования без значительного удорожания и усложнения аппаратуры.

СИСТЕМЫ ВВОДА ПРОБЫ

 

Системы ввода пробы для жидкостного хроматографа можно разделить на ручные и автоматические. Среди ручных наиболее распространен кран-дозатор, в состав которого входят сменные петли из химически стойкого материала (легированной стали) с определёнными объёмами. Для аналитической жидкостной хроматографии применяются объём петли, объём которых колеблется в пределах 0,5 - 100 мкл. Такой метод ввода пробы обеспечивает хорошую воспроизводимость анализа и недорог. Конструкции некоторых кранов позволяют работать с переменными объёмами вводимых проб без замены петли. Это бесспорное удобство, но наличие «мёртвого объёма» не всегда обеспечивает надёжные результаты.

Автоматические дозаторы обычно бывают трёх типов: петлевого с пневматическим или электромеханическим приводом, шприцевые с дозированием калиброванным микрошприцем с остановкой или без остановки потока и дозированием с помощью насоса с остановкой или без остановки потока, причём могут быть использованы как основной, так и дополнительный насос.

В современной жидкостной хроматографии практически все автоматизированные системы ввода пробы управляются микропроцессорной техникой. В хроматографе «Милихром-5», например, имеются дозаторы двух типов. В ручном дозаторе во вращающемся роторе просверлены каналы объёмом 1, 3 и 6 мкл, которые могут быть заполнены пробой с помощью шприца и вручную подключены к потоку элюента путём поворота крана в нужное положение. Автоматическое дозирование осуществляется путем остановки подвижной фазы, поднятия герметизированной на входе в колонку дозирующей иглы, забора с помощью шприцевого насоса необходимой пробы объемом от 1 до 100 мкл и вводом ее в колонку после герметизации и при обратном ходе поршня насоса. При этом обычно вся проба размещается в дозирующей игле и “запирается” с обеих сторон “пробками” используемого элюента объемом 1 - 10 мкл. Все перечисленные операции, а также забор пробы из любой ампулы и создание восьми ступенчатого градиента подвижной фазы дозатор выполняет автоматически по командам от микропроцессорного блока.

 

БЛОКИ КОНТРОЛЯ ТЕМПЕРАТУРЫ

Большинство разделений в ВЭЖХ осуществляется при температуре окружающей среды. Использование повышенных температур в изотермическом режиме анализа изменяет селективность разделения, способствует снижению вязкости растворителя, позволяет увеличить эффективность колонки. Для реализации режима контроля температуры возможно несколько подходов: термостатирование с циркуляцией и без циркуляции воздуха; жидкостное термостатирование колонки с циркуляцией теплоносителя от термостатируемого источника; пассивное термостатирование металлического блока или специального термостата, в котором расположены хроматографические колонки, непосредственный нагрев элюента. В современных жидкостных хроматографах температурный контроль полностью автоматизирован и осуществляется с помощью микропроцессора; обычный диапазон температур составляет от 35 до 99 0С.

 

7.4. ДЕТЕКТОРЫ

 

В ходе развития ЖХ было испытано более 20 типов детекторов для ЖХ. Основную массу предложенных детекторов можно разделить на оптические, электрические, электрохимические и детекторы для измерения радиоактивных веществ. В некоторых детекторах используют сразу несколько принципов детектирования, причем такие детекторы можно разделить на две группы: в первой ­– механическое совмещение нескольких разных или одинаковых типов детекторов в единой конструкции , во второй – регистрация различных физико-химических явлений в одной ячейке детектора. К первой группе детекторов можно отнести электрохимические детекторы (ЭХД) с двумя рабочими электродами, один из которых окислительный, а другой восстановительный. Типичными представителями второй группы являются кварцевый флуориметрический – фотоакустический - фотоионизационный детектор или ультрафиолетовый - электрохимический детектор.

 

Оптические детекторы

 

Оптические детекторы можно разделить на следующие классы: абсорбционные, работающие в ультрафиолетовой области спектра (190 – 380 мм) – УФД; адсорбционные для видимой области спектра (380 – 800 мм) – ВИД; инфракрасные детекторы (800 – 5000 нм) – ИКД; рефрактометрические различных типов – РМД; эмиссионные, флуориметрические различных конструкций – ФМД; хемилюминесцентные – ХЛД.

Наиболее часто в жидкостной хроматографии применяют фотометрические детекторы, работа которых основана на измерении поглощения (абсорбции) света в ультрафиолетовой или видимой областях спектра. Это связано с тем, что большинство химических соединений имеют достаточно интенсивные полосы поглощения в диапазоне дли волн 200 - 800 нм. Наличие подходящих растворителей, прозрачных в этом диапазоне длин волн, делает фотометрические методы наиболее пригодными для градиентного элюирования.

Фотометрические детекторы имеют достаточно высокую чувствительность для поглощающих свет веществ, высокий линейный динамический диапазон (до 105), малый рабочий объем ячеек (< 1 мкл), небольшое экстраколоночное расширенрие пиков и высокую воспроизводимость показаний. Они являются недеструктивными, относительно нечуствительными к колебаниям потока подвижной фазы и изменениям температуры, достаточно удобными в работе, обеспечивающими возможность выбора длин волн.

Чувствительность УФД может доходить до 0,001 е.о.п. на всю шкалу при 1 % шума. При такой высокой чувствительности могут быть зафиксированы малые количества ( до нескольких нг) слабо абсорбирующих УФ веществ. Широкая линейная область УФД позволяет анализировать как примеси, так и основные компоненты на одной хроматограмме.

Фотометрические детекторы, в свою очередь, подразделяют на детекторы с фиксированной длиной волны (УФД), детекторы со сменной с помощью фильтров длиной волны или фильтровые фотометры (ФУФД) и спектрофотометрические детекторы с детектированием в определенной области длин волн (СПФ).

Наиболее простые и дешевые УФД широко применяют в высокоэффективных жидкостных хроматографах, особенно в приборах, предназначенных для массовых анализов.

При применении ртутной лампы низкого давления, обладающей высокой стабильностью и долгим времен жизни (более 5000 ч), детектирование проводят на длине волны 254 нм, которой соответствует 90 % энергии излучения. На длине волны 254 нм высоким поглощением обладают многие органические соединения (ароматические, гетероциклические, кетоны и др.).

В УФД свет от источника излучения проходит через проточную ячейку, в которую из хроматографической колонки поступает поток элюента. Наиболее часто применят ячейки с длиной оптического пути 10 мм, диаметром светового канала 1 мм, рабочим объемом около 8 мкл. Такие ячейки подходят главным образом для аналитических колонок внутренним диаметром 4 - 6 мм, заполненных сорбентом с размерами частиц около 5 мкм. Рабочий объем ячейки является одним из важнейших ее параметров, так как, например, ячейка объемом 8 - 10 мкл может привести к размыванию пика на 30 -50 мкл и может оказаться непригодной для пиков шириной менее 100 мкл. Уменьшение объема ячейки может быть достигнуто двумя путями: уменьшением длины оптического пути и уменьшением диаметра канала ячейки. Последнее приводит к падению интенсивности проходящего через нее света и к увеличению шума. Оба эти эффекта снижают чувствительность детектирования.

Оптические детекторы с целью компенсации фона чаще всего имеют две ячейки: рабочую и сравнительную. Для двухканального детектирования используют следующие методы подключения сравнительных ячеек: статический, при заполнении сравнительной ячейки чистым растворителем; динамический, путем разделения потока от насоса на две части и пропускания одного из них через рабочую, а другого через сравнительную колонку и сравнительную ячейку.

На рис. 30 приведена принципиальная схема монохроматического УФД. УФ-свет с длиной волны 254 нм от ртутной лампы низкого давления 4 проходит через проточную ячейку 3, ограниченную кварцевыми окнами 2, и попадает на фотоприемник 1. Свет также проходит через нейтральный фильтр 5 на сравнительный фотоприемник 6. Сигналы с фотоприемников 1 и 6 поступают на логарифмический усилитель, который выдает дифференциальный сигнал в зависимости от концентрации пробы. Сигнал записывается регистратором и обсчитывается интегратором.

 

 

Рис. 30. Принципиальная схема монохроматического УФД:

1,6 - фотоприемники; 2 - кварцевые окна; 3 - проточная ячейка; 4 - источник УФ- излучения; 5 - фильтр

 

Одной из основных проблем конструирования фотометрических детекторов является обеспечение возможности фотометрирования в достаточно широком диапазоне длин волн. Это необходимо для получения максимальной чувствительности на длине волны, соответствующей ширине полосы максимального поглощения вещества.

Спектральный диапазон и степень его разделения на поддиапазоны зависит от спектральной характеристики источника излучения и от способа выделения необходимой спектральной полосы, осуществляемого до измерительной ячейки или после нее.

Некоторые источники излучения имеют линейчатый спектр (например, ртутная лампа – 254; 303; 313; 365; 464; 436; 546 нм и т.д.), другие – непрерывный спектр (например, дейтериевая лампа – 190-600 нм). Интенсивность их излучения в пределах рабочего диапазона приблизительно одинакова.

Характерной особенностью многих фильтровых УФД является использование в них источников линейчатого спектра. Кроме ртутной применяют кадмиевую и цинковую лампы с линиями на 229 и 214 нм соответственно. Применяют также преобразователи излучения с 254 на 280-290 нм и другие длины волн, отсутствующие в спектре ртути.

Спектрофотетрический детектор предназначен для фотометрирования элюата, выходящего из хроматографической колонки, при различных длинах волн в достаточно широком спектральном диапазоне (обычно 190 - 360 нм). СПФ состоит из источника света, монохроматора и фотометра. В качестве источника света используется дейтеривая лампа. Изменение длины волны осуществляется поворотом дифракционной решетки монохроматора (3600 штрихов на 1 мм) с помощью шагового двигателя. Монохроматический световой пучок, управляемый вибратором, поочередно проходит через рабочую и сравнительную проточные ячейки, после чего производится измерение разности в интенсивности обоих пучков.

а б

Рис. 31. Фотодиодные УФ-детекторы для жидкостной хроматографии с механическим движущимся фотодиодом (а) и с фотодиодной матрицей (б):

1 - источник УФ-излучения; 2 - диафрагма; 3 - конденсор; 4 - проточная ячейка; 5 - дифракционная решетка; 6 - фотодиод; 7 - фотодиодная матрица

 

В современных СПФ детекторах часто находит применение фотодиодная матрица. Оптические схемы двух типов фотодиодных УФ-детекторов приведены на рис. 31. В таких детекторах непрерывное излучение источника 1 проходит через проточную рабочую ячейку 4 и попадает на дифракционную решетку 5. Луч отклоняется и фокусируется на плоскости, где расположен механически движущийся фотодиод 6, сканирующий спектр по мере движения вдоль него, или фотодиодная матрица. В последнем случае спектр проецируется на матрицу, состоящую из 200 - 250 элементарных фотодиодов, и выдает информацию сразу обо всем диапазоне длин волн с дискретностью 2 - 5 нм. Обработка и запись спектров проводится с помощью компьютера.

К фотометрическим детекторам относится также детектор, работа которого основана на поглощении света в инфракрасной области спектра (ИКД). Некоторые функциональные группы органических соединений имеют характеристические частоты в ИК - спектрах этих соединений, поэтому ИКД пригоден для идентификации органических соединений. Одним из основных условий работы ИКД является прозрачность применяемых растворителей в ИК - области спектра. Наиболее подходящими, однако редко применяемыми в хроматографической практике, растворителями являются CCI4 ,CHCI3 и CS2.

Адсорбция ИК - света может быть использована как для селективного, так и неселективного детектирования. Если ранее детекторы этого типа применяли главным образом в эксклюзионной хроматографии с колонками большого диаметра, то в настоящее время они всё шире внедряются в высокоэффективную жидкостную хроматографию.

Для фотометрических детекторов постоянно ведется поиск новых источников излучения, конструкций проточных ячеек, методов регистрации и обработки сигналов. Эти исследования, несомненно, расширят применение фотометрических детекторов.

Рефрактометрические детекторы (РМД) в отличие от фотометрических детекторов, реагирующих только на вещества, поглощающие свет в ультрафиолетовой, видимой и инфракрасной области спектра, являются наиболее универсальными детекторами в жидкостной хроматографии. Принцип действия РМД основан на дифференциальном измерении показателя преломления чистого растворителя и раствора анализируемого вещества в этом растворителе. Вклад растворенного вещества в изменение показателя преломления растворителя пропорционален объемной концентрации этого вещества, причем растворитель также является детектируемым веществом, так как имеет определенный показатель преломления. РМД обладает средней чувствительностью, а его показания в сильной степени зависят от колебаний параметров, влияющих на состав подвижной фазы, таких как давление, температура и концентрация анализируемого вещества. Поэтому РМД практически непригоден для градиентной хроматографии.

В некоторых случаях могут быть выбраны пары растворителей, имеющих близкие показатели преломления. При этом становится возможным осуществить градиентное элюирование в определенных пределах концентраций смеси растворителей.

Недостатками детектора являются также его нечувствительность к веществам, имеющим показатель преломления, одинаковый с растворителем, и более низкая чувствительность по сравнению со спектрофотометрическими детекторами.

Работа большинства современных РМД основана на трех различных принципах измерения сигнала: отклонении, отражении, интерференции.

В первом методе угол отклонения монохроматического света, проходящего через проточную оптическую ячейку, пропорционален концентрации пробы и контролируется электромеханическим устройством, движение которого преобразуется в электрический сигнал.

Другой метод измерения основан на законе отражения света (закон Френеля), согласно которому интенсивность отраженного света, подающего на поверхность границы раздела жидкости и стекла, пропорциональна углу падения и разности показателей преломления двух сред. Преимуществом детекторов, работающих на этом принципе, является меньший объем ячеек (< 3 мкл), в связи с чем они могут работать при небольших расходах элюента и с высокоэффективными колонками. Однако чувствительность таких детекторов в 50-100 раз ниже чувствительности других типов РМД.

Работа РМД третьего типа основана на интерферометрическом принципе сдвига.

Различие показателей преломления рабочего и сравнительного потока элюента приводит к разнице в длине оптического пути, которая измеряется интерферометрическим РМД как изменение длин волн света. Показания этого типа РМД достаточно линейны, а чувствительность в 10 раз выше, чем для других РМД. При оптимальных рабочих условиях возможно детектирование около 3 мкг/мл растворенного вещества. РМД может детектировать любой тип анализируемых веществ, независимо от температуры кипения, структуры, молекулярной массы и других физико-химических свойств. Детектор хорошо применим в тех случаях, когда нет необходимости в высокой чувствительности, например в препаративной хроматографии.

Принцип действия флуориметрического детектора (ФМД) основан на измерении флуоресцентного излучения поглощенного света. Поглощение обычно проводят в УФ-области спектра при длине волны максимального поглощения для данной группы веществ, а излучение измеряют на выходе фильтра, не пропускающего лучи возбуждения. Длины волн флуоресцентного излучения всегда превышают длины волн поглощенного света. В связи с тем, что детектирование ведется от нулевой интенсивности флуоресценции, ФМД более чувствительны по сравнению с детекторами поглощения.

Для измерения обычно используют два типа конструкций ФМД, представленных на рис. 32. Свет от УФ-источника излучения 1 проходит через фильтр 2 и фокусируется в проточной ячейке 3 с прямоугольной или (рис. 32 а) или линейной (рис. 32 б) конструкцией ввода и вывода света эмиссии. Излучение проходит также через фильтр 4 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При применении ФМД подвижная фаза не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине излучения.

Излучение проходит также через фильтр 4 и измеряется с помощью фотоприемника 5. При применении ФМД подвижная фаза не должна поглощать свет ни на длине волны поглощения, ни на длине излучения.

 

а б

Рис. 32. Прямоугольная (а) и линейная со сравнительной ячейкой (б) конструкция флуориметрических детекторов:

1 - источник света; 2,4 - фильтры; 3 - проточная ячейка; 5 - фотоприемник; 6 - сравнительная ячейка; 7,8 - полупрозрачные зеркала; 9 - ловушка света. Сплошная линия - -свет возбуждения, пунктирная - свет эмиссии

 

Для сильно флюорисцирующих веществ предел детектирования достигает 10-9 г/мл. При соответствующем выборе системы растворителей ФМД пригоден для использования в градиентной хроматографии. С помощью ФМД с высокой чувствительностью можно детектировать аминокислоты, амины, витамины и стероиды. Высокая чувствительность является одним из главных его преимуществ. ФМД можно также применять для количественного определения микропримесей веществ и качественного определения ароматических углеводородов, биологически активных соединений, метаболитов и других флуоресцирующих соединений.

Применение ФМД в ВЭЖХ дает возможность повысить селективность детектирования многих соединений. Получение флуоресцирующих производных с помощью химических реакций значительно расширяет эту возможность. Флуоресцентное детектирование с одновременным изменением рН подвижной фазы после колонки дает возможность увеличить флуоресценцию некоторых соединений и делает ФМД более специфичным. Селективность детектирования может быть также увеличена путем более тщательного выбора длины волны детектирования.






Читайте также:

Последнее изменение этой страницы: 2016-03-16; Просмотров: 241; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2017 год. Все права принадлежат их авторам! (0.225 с.) Главная | Обратная связь