Тема: Приготовление питательной среды для культивирования клеток

⇐ ПредыдущаяСтр 2 из 5Следующая ⇒

Цель занятия: подготовка лабораторной посуды, приготовление культуральной среды, определение рН, стерилизация питательной среды и ее контроль.

Материальное обеспечение: стерильные флаконы ( объемом 500мл), бидистиллированная вода, концентрат среды RPMI-1640, 100 мМ пируват натрия, 7, 5% бикарбонат натрия, НЕРЕS, L-глютамин, 2-меркаптоэтанол, мембранные фильтры с диаметром пор 0, 22 мкм, фильтродержатели, фетальная сыворотка.

Культура клеток – это клетки, живущие и размножающиеся в искусственных условиях (in vitro). Как известно, в природных условиях клетки животных находятся в тканях и органах и защищены от механического воздействия внешней среды. При культивировании клетки нуждаются во множестве компонентов питательной среды минеральной и органической природы. Для нормального роста и размножения клеток вне организма необходимы комплекс физико-химических факторов (температура культивирования, концентрация водородных ионов, определенное содержание неорганических соединений, углеводов, аминокислот, белков, витаминов, кислорода и углекислоты).

Для культивирования клеток применяют в основном искусственные питательные среды (синтетические) – среда Игла, среда Искова, среда 199, среда Дульбекко и т.д. В их состав входит множество компонентов: заменимые и незаменимые аминокислоты, витамины, компоненты нуклеиновых кислот, углеводы, источники липидов, минеральные соли и другие вещества. В настоящее время наиболее применимой при культивировании гибридом является среда RPMI-1640 из серии сред RPMI (Roswell Park Memorial Institute), которая выпускается в виде 10-кратных концентратов и сухих порошков.

Для поддержания жизнедеятельности клеток большое значение имеет солевой состав питательной среды, создающей необходимую буферность и изотоничность. Для поддержания осмотического давления и обеспечения внутриклеточных функции обязательно присутствие в питательной среде ионов Na, К, Са, Cl, карбонатов и фосфатов. Ионы бикарбоната натрия нужны для осуществления биохимических процессов в клетке, кроме того они выполняют одну из главных функции буфера в системе, поддерживающей рН.

Оптимальный рост и развитие клеток обеспечиваются при рН 7, 2-7, 4. Значительные отклонения рН среды от указанного выше оптимума отрицательно сказываются на росте культуры клеток. Для роста клеток необходимы кислород и углекислота, при участии которых образуется энергия и осуществляется биосинтез составляющих клетку компонентов. Среди аминокислот особенно важная роль принадлежит глютамину, который несет разнообразные функции в обмене веществ культуры клеток. Поскольку последний является термолабильным компонентом, ее вводят в среду при приготовлении.

Питательные среды готовят на сверхчистой (бидистиллированной) воде (очищенной с помощью ионообменных смол). Дистиллированная вода, полученная в металлических перегонных аппаратах, содержит ионы тяжелых металлов (свинец, медь, цинк и др.) и непригодна для приготовления культуральных сред, так как клетки высокочувствительны даже к небольшим их концентрациям. Все среды и растворы стерилизуются путем фильтрации через мембранные фильтры с диаметром пор 0, 22 мкм.

Обязательным компонентом культуральных сред является сыворотка крови. В ее состав входит ряд биологически активных веществ, необходимых для роста клеток in vitro. Содержащаяся в сыворотке активная фракция альбуминов способствует прикреплению клеток к поверхности стекла. Наибольшей способностью поддерживать рост гибридных клеток обладает сыворотка плода коровы (СПК). Для уменьшения возможной токсичности комплемента сыворотки ее инактивируют прогреванием при 56^оС в течение 30 минут. Для культивирования клеток сразу после слияния, а также после клонирования используют высокую концентрацию СПК (15-20%). После адаптации гибридом концентрацию СПК снижают до 10%.

Приготовление культуральной среды. Для культивирования гибридом используют 10-кратный концентрат среды RPMI- 1640 (Flow Laboratories, Великобритания).

№	Компоненты культуральной среды	Неполная среда	Полная среда
	Деионизированная вода	863 мл	86, 3 мл
	10х концентрат RPMI-1640	100мл	10мл
	100мМ пируват натрия	10 мл	1 мл
	7, 5% бикарбонат натрия	26, 7 мл	2, 67 мл
	HEPES	2, 283 г	0, 228 г
	L-глютамин	0, 3 г	0, 03 г
	2-меркаптоэтанол	0, 003мл	0, 0003 мл
	Сыворотка плода коровы	-	10 мл
	Итого	1000мл	100мл

рН среды доводят до 7, 2-7, 4 с помощью 0, 1н NaOH и стерилизуют фильтрованием через мембранные фильтры с диаметром пор 22 мкм (Flow Laboratories, США). СПК является одним из самых дорогих компонентов среды культивирования, поэтому на многих этапах гибридомной технологии используют неполную культуральную среду (для отмывания клеток, приготовления клеточных суспензии и т.д.).

Полную ростовую среду для культивирования гибридных клеток готовят добавлением в неполную ростовую среду (10% к объему среды) стерильной СПК (Sigma, США), предварительно инактивированной нагреванием при 56⁰С в течение 30 мин.

Для определения стерильности приготовленной неполной культуральной среды из нее берут образец в количестве не менее 1% от общего объема (например: 5 мл образца от 500 мл среды), добавляют СПК в соотношении 9: 1 и выдерживают в СО₂ – инкубаторе в течение 5 дней. Среду считают стерильной, если по истечении указанного времени она остается прозрачной и не наблюдаются в ней признаки образования осадка или пленки.

Литература:

1. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология) // Методы культивирования клеток, Л.; Наука.1987.с.194-205.

2. Бутенко Р.Г., Гусев М.В., Киркин А.В. Биотехнология. Кн.3. Клеточная инженерия. Методы получения моноклональных антител. Стр.136-167.

3. Булашев А.К. Моноклональные антитела в диагностике бруцеллеза. Акмола.: Изд-во Акмолинского аграрного университета, -1995. –214с.

Контрольные вопросы: 1.Определение культуры клеток. 2.Факторы культивирования клеток. 3.Компоненты синтетических сред и их назначение. 4.Бидистиллированная вода и стерилизация сред. 5.Значение фетальной сыворотки крови и ее оптимальная концентрация.

Занятие № 3

Тема: Иммунизация

Цель занятия: определение вида экспериментального животного, назначение процесса иммунизации и его зависимость от природы антигена, проведение иммунизации и определение ее эффективности.

Материальное обеспечение: беспородные мыши, мыши линии Ва1В/с, иммунизируемый антиген, шприцы для инъекции, полный адъювант Фрейнда.

Выбор экспериментального животного для иммунизации определяется наличием родительских миеломных линий, возможностью получения гибридных клеток этих линий и иммунных лимфоцитов, а также способностью к размножению полученных гибридом в организме данного вида животного. Обычно для иммунизации используют линии мышей и крыс, сингенных в отношении миеломных клеток. Подходящие миеломные клетки мышей и крыс широко распространены, и кроме того, не представляет сложностей выращивание полученных гибридом в организме этих животных. При иммунизации мышей широко используют линию BalB/с. Для получения антителопродуцирующих гибридом используются лимфоидные клетки (лимфоциты), выделенные из различных источников, например из селезенки или лимфатических узлов.

Назначение процесса иммунизации состоит в том, чтобы увеличить долю лимфоидных клеток, продуцирующих антитела заданной специфичности, и перевести эти клетки в функциональное состояние, при котором они способны сливаться и образовывать антителообразующие гибридные клетки. Экспериментально установлено, что для гибридизации необходимо выделять клетки животных через 3-4 сутки после последнего введения антигена, т.е. тогда когда в лимфоидных органах много активно пролиферирующих клеток.

Конкретная схема иммунизации зависит от природы антигена и его иммуногенности. Антигены клеточной поверхности (цельные клетки) являются сильными иммуногенами, тогда как большинство растворимых антигенов (белки, полисахариды и т.д.) – слабые иммуногены. В последнем случае необходимо применять различные адъюванты, усиливающие иммунный ответ (полный или неполный адъювант Фрейнда – ПАФ или НАФ). Обычно антиген вводят неоднократно, что необходимо для развития сильного иммунного ответа. По ходу иммунизации необходимо определять титр антител к антигену (титр антител – величина, обратная разведению сыворотки, при которой степень иммунологической реакции снижается в два раза по сравнению с максимальной). Обычно это делают перед последней иммунизацией. В опыт отбирают животных с высоким титром антител. Не следует ожидать хороших результатов гибридизации, если при иммунизации животных отсутствует образование антител или они образуются в низком титре. Для иммунизации используют мышей 8- недельного возраста линии BALB/с (Таблица 1).

Таблица 1 – Схема иммунизации мышей линии BALB/c

(по И.И.Фридлянской, 1988)

№	Сутки до слияния	Доза антигена (мкг на мышь)	Способ введения
		100 мкг в0, 1 мл неполного адъюванта Фрейдна	Внутрибрюшинно
		100 мкг в ЗФР (рН 7, 2)	Внутрибрюшинно
		100 мкг в ЗФР (рН 7, 2)	Внутрибрюшинно
		100 мкг в ЗФР (рН 7, 2)	Внутрибрюшинно
		100 мкг в ЗФР (рН 7, 2)	Внутрибрюшинно
		Слияние

Мышам в первый день иммунизации вводят внутрибрюшинно по 100 мкг антигена в 0, 1 мл неполного адъюванта Фрейнда (Gibco, США). На 7, 11, 12, 13-й дни иммунизации животным инъецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе, рН 7, 2-7, 4. Спустя три дня после последней иммунизации извлекают селезенки с тех мышей, которые имеют более высокие титры в иммуноферментном анализе(ИФА).

Литература :

Контрольные вопросы: 1.Чем определяется выбор экспериментального животного. 2. Назначение процесса иммунизации. 3. Иммуногенность антигенов. 4.Титры иммунизации и их значение.

Занятие №4

Тема: Подготовка миеломных клеток к гибридизации.

Цель занятия: значение миеломных клеток в гибридизации, их источники и условия культивирования.

Материальное обеспечение: ламинарный бокс, СО₂-инкубатор, культуральная среда, сосуд Дьюара, низкоскоростная центрифуга, пластиковая ампула с замороженными миеломными клетками, водяная баня, 24-луночные планшеты для культивирования.

Одной из предпосылок возникновения метода гибридомной технологии является разработка методики получения и культивирования миелом - злокачественных опухолей костного мозга. Миеломы индуцируют у животных путем внутрибрюшинного введения минеральных масел или инертного твердого пластика. Миеломные клетки (линии опухолевых клеток лимфоидного происхождения) представляют собой один клон клеток-антителопродуцентов, т.е являются потомками одной клетки. Они продуцируют аномальные иммуноглобулины (с неизвестной специфичностью), но сходные по структуре и обладают способностью бесконечно культивироваться in vitro. Экспериментаторам удалось получить миеломы только у двух линии мышей - BalB/с и NZB. Миеломные клетки мышей оказались чрезвычайно удобными для изучения биохимии продукции иммуноглобулинов. В результате успешных опытов по получению гибридных клеток, образующихся при слиянии (гибридизации) двух миелом, оказалось, что в полученных гибридах синтезировались иммуноглобулины обеих родительских миеломных линии. Впоследствии исследователям удалось выделить линии миеломных клеток мышей, в которых отсутствовала экспрессия (образование) цепей иммуноглобулинов – Sp2/0 Ag14 и X63Ag8 6.5.3. Преимуществом этих клеток является утрата ими способности синтезировать собственные иммуноглобулины.

В качестве партнеров для гибридизации используют генетически маркированные (мутантные) клетки или линии миеломных клеток дефектные по некоторым ферментам, участвующим в синтезе нуклеотидов ГГФРТ или ТК ( ГГФРТ -гипоксантингуанинфосфорибозилтрансфераза или ТК- тимидинкиназа). Мутантные по ферменту ТК линии миеломных клеток резистентны к токсическому аналогу тимидина – 5-бромдезоксиуридину, по ферменту ГГФРТ – резистентны к токсическому аналогу гуанина – 8-азагуанину. Эти токсические аналоги настолько сходны с нормальными пуриновыми и пиримидиновыми основаниями, что поглощаются клеткой и включаются в биосинтез ДНК. Вприсутствии токсических аналогов выживают только те миеломные клетки, в которых отсутствует фермент, способствующий включению этого аналога в ДНК. Такие генетически маркированные линии миеломных клеток в дальнейшем не способны к выживанию на селективной среде ГАТ, что позволяет осуществить селекцию гибридом (Рисунок 2).

Рисунок 2–Принципы селекции и отбора мутантных миеломных клеток

Селективный маркер устой-чивости к определенному ингибитору (токсическому аналогу нуклеотидов ДНК)	Ферменты, способствующие включению токсического аналога нуклеотидов в ДНК

5-бромдезоксиуридин (аналог тимидина)	8-азагуанин (аналог гуанина)	ТК-тимидинкиназа	ГГФРТ- гипоксантингуанинфосфорибозил трансфераза

	Мутаген
	¯
Подавление активности генов, кодирующих ТК или ГГФРТ
	¯
Отбор мутантных миеломных клеток с генетическим дефектом (выживают в присутствии токсического аналога)
¯		¯
мутантные по ТК		мутантные по ГГФРТ
¯		¯
(резистентны к 5-бромдезоксиуридину)		(резистентны к 8-азагуанину)

Для исключения реверсии (хромосомных мутации) миеломные клетки целесообразно каждые 6 мес культивировать на среде RPMI-1640 в присутствии токсического аналога. Миеломные клетки растут частично в виде монослоя, частично в виде суспензии. Плотность культивирования для этих клеток – 1, 0-1, 5 х10⁶ кл/мл.

Таблица 2 - Характеристика основных миеломных линий мышей, используемых в гибридомной технологии

№	Свойства	Определения
	Линии мышей – источник миеломных линии	BALB/c
	Названия миеломных линии	Sp2/0- Ag 14 Р3/Х63- Ag8.653
	Синтез иммуноглобулинов	Отсутствует
	Дефектность по ферменту, участвующему в синтезе нуклеотидов	ГГФРТ
	Устойчивость к токсическому аналогу нуклеотидов	8-азагуанин

Подготовка миеломных клеток к гибридизации. Для гибридизации используют миеломную линию клеток Х 63 Ag 8.6.5.3 (резистентную к 8-азагуанину). Если используемая линия клеток обладает хорошей способностью образовывать гибридомы, необходимо размножить их и заморозить достаточное количество ампул в жидком азоте.

Замороженные пластиковые ампулы с миеломными клетками из сосудов Дьюара с жидким азотом переносят в водяную баню (37^оС) до полного растворения льда, Ампулы размораживаются в течение 0, 5-1 мин, что зависит от материала, из которого изготовлены ампулы. Жизнеспособность клеток в суспензии зависит от скорости размораживания. Установлено, что при ее увеличении количество выживших клеток в суспензии возрастает. При нарушении герметичности ампулы могут взрываться. Содержимое ампулы переносят в центрифужную пробирку с 10 мл холодной неполной ростовой среды и перемешивают, затем центрифугируют 5-7 минут при 1000 об/мин. Супернатант (надосадочную жидкость) сливают, затем к осадку клеток добавляют необходимый объем полной ростовой среды, суспендируют и переносят в ячейки 24-х луночного планшета на слой «питающих клеток». Инкубируют клетки при 37^оС в атмосфере с 5% СО₂. Рост клеток ведут до достижения плотности монослоя в пределах 75-80% или концентрации клеток не выше 0, 5х10⁶ млн/см. Затем легким суспендированием ростовой среды снимают клетки и взвесь переносят пластиковые матрасы. Объем суспензии в матрасе увеличивают в 3-5 раза путем добавления полной ростовой среды. Для гибридизации используют клетки, находящиеся в логарифмической фазе роста.

Литература :

Контрольные вопросы: 1.Миеломы и их свойства.2. Линии миеломных клеток и их преимущества. 3. Условия культивирования миеломных клеток.

Занятие №5

Тема: Подготовка «питающего слоя» (выделение макрофагов)

Цель занятия: значение «питающего слоя» при культивировании гибридом и освоение методики выделения макрофагов.

Материальное обеспечение: беспородные мыши, стерилизатор, щприцы объемом 10 мл, иглы инъекционные, пинцеты, ножницы, препаровальная подставка, пластиковая посуда.

Техника получения гибридом в сущности представляет собой получение клеточного потомства из одной клетки, посеянной при очень низкой плотности (1-4 клетки на 0, 2 мл среды). Известно, что при низкой плотности рост клеток сильно замедляется и в значительной степени определяется наличием в среде в достаточном количестве различных питательных и стимулирующих факторов. Размножение медленно растущих гибридных клеток можно стимулировать добавлением неразмножающихся клеток питающего слоя («feeder cells»), которые снабжают культуру различными ростстимулирующими факторами. Чаще всего в качестве клеток питающего слоя используют перитонеальные клетки (макрофаги). Макрофаги выполняют еще одну важную функцию: они фагоцитируют погибающие в ходе селекции неслившиеся миеломные клетки. Последние при гибели выделяют в среду токсины, ингибирующие рост гибридных клеток.

Перитонеальные клетки получают от беспородных мышей (сингенность мышей не является обязательным требованием при выборе донора «питающих» клеток). Плотность культивирования для этих клеток - 0, 5-1 млн. клеток в 1 мл, т.к при большей концентрации активированные макрофаги могут уничтожать гибридомные клетки.

Приготовление «питающего слоя» из перитонеальных макрофагов. За 2-3 дня до слияния клеток, в стерильных условиях выделяют пери-тонеальные макрофаги от беспородных мышей и высевают их в ячейки 96-луночных планшет для культивирования. Мышь забивают путем цервикаль-ной дислокации, кожные покровы обрабатывают спиртом и закрепляют на препаровальной подставке. Пинцетом растягивают конечности и фиксируют их. Производят продольный разрез кожи по белой линии живота, а также верхние и нижние разрезы. Растягивая кожу в противоположных направле-ниях, обнажают брюшную полость. Шприцем вводят в брюшную полость 10 мл неполной культуральной среды и в течение 5 минут производят раздраже-ние брюшины путем легкого постукивания пинцетом. Затем отсасывают суспензию перитонеальных макрофагов из брюшной полости и осаждают их центрифугированием при 1000 об/ мин в течение 10 минут. Осадок клеток ресуспендируют в полной ростовой среде из расчета 1х10⁶ клеток в 1 мл и высевают в ячейки 96- луночного планшета. Клетки выращивают в СО₂ – инкубаторе при температуре 37⁰С в атмосфере с 5% СО₂.

Литература :

Контрольные вопросы: 1. Значение «питающего слоя» при получении гибридом. 2. Источники «макрофагов» и их оптимальная концентрация.

Занятие №6

⇐ Предыдущая 123 4 5 Следующая ⇒