Работа № 4. Влияние реакции среды (оптимум рН) на действие ферментов слюны.

⇐ ПредыдущаяСтр 8 из 29Следующая ⇒

Для проявления максимальной каталитической активности ферментов требуются определенные условия, в том числе оптимальная концентрация водородных ионов. Каждый фермент наиболее активен в пределах довольно узкой зоны рН, называемой оптимум рН. Активность ферментов уменьшается, если рН меняется в любую сторону от оптимального значения. Отклонение рН от оптимума влияет на степень ионизации фермента и субстрата, может нарушить связь между белковой частью фермента и их простетическими группами, может влиять на связывание субстрата с ферментами.

Оптимальное значение рН для некоторых ферментов

Фермент	рН
Пепсин	1, 5-2, 5
Трипсин	8, 0-9, 0
Сахараза кишечная	6, 2
Амилаза слюны	6, 9-7, 0
Липаза желудочного сока	6, 0
Липаза панкреатическая	7, 0-8, 5
Каталаза	7, 0

Порядок выполнения работ

В 7 предварительно пронумерованных пробирок наливают 0, 2 м раствор двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0, 1 м раствор лимонной кислоты в соотношениях, указанных в таблице. Получают буферные растворы с рН от 5, 6 до 8, 0. В каждую пробирку добавляют по 10 капель 1% раствора крахмала, по 10 капель слюны, разведенной в 100 раз. Перемешивают содержимое пробирок и помещают их в водяную баню или термостат при температуре 38^о на 5-10 минут (в зависимости от индивидуальных особенностей активности слюны).

Влияние рН среды на активность амилазы

№ п/п	Кол-во 0, 2 м р-ра Na₂HPO₄, мл	Кол-во р-ра лимонной к-ты, мл	рН смеси	Кол-во 0, 5% р-ра крахмала на 1% р-р NaCl	Кол-во разведенной слюны(1: 100), мл	Окрашивание с йодом
1.	0, 58	0, 42	5, 6	по 10 капель	по 10 капель
2.	0, 63	0, 37	6, 0
3.	0, 69	0, 31	6, 4
4.	0, 77	0, 23	6, 8
5.	0, 87	0, 13	7, 2
6.	0, 94	0, 06	7, 6
7.	0, 97	0, 03	8, 0

Затем во все пробирки добавляют по 1 капле раствора йода в йодистом калии, перемешивают, наблюдают окраску и определяют рН, при котором амилаза действует наиболее активно. В зависимости от активности слюны ее можно разводить не в 100, а в 50 или 10 раз.

Эталоны ответов к тестовым заданиям

Вид 1. 1.1.-в; 1.2. –б; 1.3. –а;

Вид 2. 2.1.-В; 2-А; 3-Д; 4-Б; 5-Е; 6-Г;

2.2.-Г; 2-Б, В, Д; 3-Г; 4-Г; 5-Б; 6-Е; 7-Б.

Вид 3. 3.1. – 2, 4; 3.2. -1, 2, 3, 4, 5.

Вид 4. 4.1.- Д (-, +, -); 4.2.-Д (-, +, -).

Эталоны ответов на ситуационные задачи

Задача 1. Как и большинство протеолитических ферментов, трипсин обладает специфичностью действия - этот фермент активен в отношении пептидных связей, образованных карбоксильной группой аргинина и лизина. Молекулы трипсина не атакуют друг друга, т.к. аминокислотные последовательности на поверхности молекулы трипсина не соответствуют его специфичности.

Задача 2. Согласно теории индуцированного соответствия (теории Кошленда), связываясь с активным центром, субстрат вызывает изменение пространственной формы молекулы фермента и переводит его в более устойчивую, стабильную конформацию.

Задача 3. Наличие сильного положительного заряда, большое число свободных орбиталей (следовательно, способность связывать большое число лигандов), возможность выступать в роли как акцептора, так и донора электронов – все эти свойства переходных металлов обусловливают их участие в биокатализе в качестве кофакторов.

Занятие № 6. Кинетика ферментативных реакций. Регуляция активности ферментов. Активаторы. Ингибиторы.

Цель занятия. В результате освоения темы занятия студент освоить основные положения ферментативной кинетики, механизмы активирования и ингибирования ферментов, лежащие в основе регуляции обмена веществ и действия многих лекарств.

Студент должен
знать:	уметь:
-основные положения кинетики ферментативных реакций, зависимость скорости ферментативной реакции от [S], [E], t, pH; -механизмы активирования ферментов; -классификацию и механизм действия различных классов ингибиторов.	-объяснить механизм активирования и ингибирования; -графически изображать изменения кинетических характеристик фермента в присутствии различных видов активаторов и ингибиторов; -решать ситуационные задачи по ферментативной кинетике.

Содержание занятия. На данном занятии студентам предстоит пройти проверку выполнения домашней работы (задания для самоподготовки), ответить на тесты программированного контроля и вопросы преподавателя. Лабораторный практикум включает изучение активирующего влияния анионов хлора и ингибирующее влияние ионов меди на активность амилазы слюны, а также эксперимент по ингибированию сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой.

Методические указания к самоподготовке

Для усвоения темы выполните задания, представленные в таблице.

№№	Задание	Указания к выполнению задания

1.	Изучите основы кинетики ферментативных реакций.	1. Напишите вывод константы Михаэлиса, объясните ее физический смысл. 2. Изучите зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата: 1) напишите уравнение Михаэлиса-Ментен; 2) дайте анализ уравнения; 3) зарисуйте график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента; 4) напишите уравнение Лайнуивера-Берка и его графическое выражение. В чем преимущества графика двойных обратных величин? 3. Охарактеризуйте зависимость скорости ферментативной реакции от концентрации фермента. Приведите график зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации фермента.
2.	Изучите влияние ингибиторов на активность фермента.	1. Приведите классификацию типов ингибирования ферментов: 1) 2) 3) и.т.д. 2. Приведите примеры неспецифических ингибиторов и объясните механизм их действия. 3. Схематически изобразите механизм действия: а) конкурентного ингибитора б) неконкурентного ингибитора 4.Изобразите графики Лайнуивера-Берка для конкурентного и неконкурентного ингибирования. Как изменяются кинетические характеристики фермента (Кm, Vmax) при действии различных видов ингибиторов? 5. Дайте определение понятию «аллостерический центр». В чем особенность кинетики аллостерических ферментов? 6. Приведите примеры использования различных типов ингибиторов ферментов в качестве лекарственных средств.
3.	Изучите влияние активаторов на скорость ферментативных реакции.	1.Перечислите основные типы активировании ферментов. 2.Изучите механизмы активирующего действия ионов металлов, анионов. Приведите примеры ферментов, активируемых металлами. 3. Активация путем ограниченного протеолиза. Для каких ферментов наиболее характерен такой тип активации? Какой это имеет биологический смысл? 4. Изучите аллостерическую активацию ферментов. Приведите примеры ферментов, активируемых путем ассоциации, диссоциации субъединиц, ковалентной модификации (фосфорилирования-дефосфорилирования).

Примеры тестов контроля исходного уровня знаний

Вид 1. Выберите один наиболее верный ответ.

1.1. Гексокиназа катализирует реакцию фосфорилирования гексоз. Кm гексокиназы для аллозы составляет 8´ 10^-3моль/л, а для маннозы – 5´ 10^-6моль/л. Какой из субстратов будет фосфорилироваться с наибольшей скоростью, если их концентрация в среде инкубации одинакова и составляет 8´ 10^-7моль/л?

а) аллоза

б) манноза

в) скорость превращения обоих субстратов будет одинакова

г) имеющиеся данные не позволяют ответить на поставленный вопрос

1.2. Константа Михаэлиса ….

а) численно равна ½ V_max

б) не зависит от рН

в) численно равна [S], при которой скорость равна ½ V_max

г) зависит от концентрации фермента

Вид 2.

2.1. Регуляция активности фермента – механизм регуляции.

1. увеличение количества А. взаимодействие с белковыми

ферментативного белка ингибиторами

2. уменьшение количества Б. действие протеинкиназ

протеиназ В. индукция генов

3. модификация активности Г. ограниченный протеолиз

в результате фосфорилиро-

вания белка

4. активация зимогенов

2.2. Определите тип ингибирования

1.циклооксигеназы аспирином а) конкурентное

2.сукцинатдегидрогеназы малоновой кислотой б) необратимое

3. холинэстеразы прозерином в) аллостерическое

4. холинестеразы диизопропилфосфатом

5.ингибирование глюкозо-6-фосфотазы инсулином

2.3. Типы ингибирования ферментов – механизм.

1. необратимое 2. обратимое 3. конкурентное 4. неконкурентное 5.аллостерическое

А. молекула ингибитора вызывает стойкое изменение в молекуле фермента Б. ингибитор сходен по структуре с субстратом В. вид ингибирования, включающий конкурентное и неконкурентное ингибирование Г. ингибитор не имеет структурного сходства с субстратом и часто связывается с ферментом вне активного центра, изменяя его конформацию Д. ингибирование, связанное с изменением конформации ферментного белка в результате воздействия на регуляторный центр ферментов

Вид 3. Правильное сочетание ответов.

3.1. Лекарственные вещества-антиметаболиты являются конкурентными ингибторами, если ….

1. необратимо связываются с ферментом

2. обратимо связываются с ферментом

3. нет зависимости между степенью ингибирования и концентрацией субстрата

4. прочно соединяются с простетической группой фермента

5. вызывают денатурацию фермента

3.2 Аллостерические ферменты как правило имеют….

1. четвертичную структуру

2.сигмоидный график зависимости V от [S]

3.низкомолекулярный лиганд -регулятор

4. простетическую группу

5. высокие значения Кm

Вид 4. Определите правильность утверждений и связь между ними

4.1. При действии фосфакола (представитель фосфорорганических соединений) уменьшается количество ацетилхолина в синаптической щели, потому что происходит фосфорилирование фосфаколом ОН –группы серина в активном центре холинэстеразы.

4.2. Активность ферментов в присутствии ингибиторов снижена, потому что в присутствии конкурентных ингибиторов возникают конформационные изменения молекул ферментов.

Примеры ситуационных задач

Задача 1. Проанализируйте данные экспериментов по определению скорости ферментативной реакции при различных концентрациях субстрата, а также в присутствии ингибитора. По имеющимся данным постройте график Лайнуивера–Берка, определите Кm фермента и тип ингибирования.

Концентрация субстрата, М	Скорость реакции, мкмоль/мин	Скорость в присутствии ингибитора, мкмоль/мин
6´ 10^-6 1´ 10^-5 2´ 10^-5 6´ 10^-5 1, 8´ 10^-4	20, 8 67, 6	4, 2 5, 8 13, 6 16, 2

Задача 2. Используя график Лайнувивера-Берка, проанализируйте, как изменились кинетические характеристики фермента в присутствии ингибитора. Определите тип ингибирования.

Задача 3. Зависимость V от [S] для реакции, катализируемой транскарбамоилазой, выражается сигмоидной (S-образной) кривой. После воздействия на фермент солями ртути (II) каталитическая активность фермента резко возрастает, а кривая зависимости скорости реакции от концентрации субстрата становится гиперболической. Какие выводы о механизме активации фермента ионами ртути можно сделать? Приведите примеры других ферментов, активируемых подобным образом.

Самостоятельная работа студентов

⇐ Предыдущая 3 4 5 6 789 10 11 12 Следующая ⇒