Ростовые характеристики и дифференцировка МСК

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 4

Для сравнительной характеристики пролиферативной активности МСК, полученных из разных источников, проанализировали культуры МСК костного мозга и культуры жировой ткани. В качестве критерия для сравнения пролиферативной активности использовали время удвоения численности популяций МСК.

Наибольшее время для удвоения популяции было характерно для культур МСК, полученных из костного мозга. Время удвоения популяции МСК костного мозга было достоверно выше на всех пассажах по сравнению с МСК, полученных из других источников. Пролиферация культур МСК костного мозга сохранялась в течение 6 пассажей, остальные культуры пролиферировали 7 пассажей. После этого пролиферация прекращалась, большинство клеток в культуре были крупными (более 250 мкм) и имели полигональную форму, с

неровными краями и множеством отростков. В течение 7-10 дней после прекращения пролиферации наблюдали массовое открепление клеток от культурального пластика и значительное увеличение доли погибших клеток. На данной стадии отмечали гибель культуры и ее утилизировали.

Время удвоения популяции МСК, полученных из жировой ткани было схожим при культивировании до 6 пассажа. При дальнейшем культивировании (после 7 пассажа включительно) время удвоения популяции было достоверно выше 0, 05 для МСК жировой ткани. Из МСК жировой ткани 4 прекратили пролиферировать после 7 пассажа, 2 – после 8 пассажа и клетки одной из культур пролиферировали в течение 9 пассажей.

Таким образом, МСК костного мозга обладали минимальным пролиферативным потенциалом из всех проанализированных культур. Пролиферативная активность МСК, полученная из жировой ткани была сходной на ранних пассажах, а при дальнейшем культивировании снижалась более резко у МСК жировой ткани.

МСК, полученные из костного мозга и жировой ткани обладали способностью к дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Анализ способности к дифференцировки проводили на 3 пассаже.

При исследовании способности МСК к дифференцировке через 3 сутки после добавления в среду адипогенных стимулов в культурах появлялись клетки, содержащие липидные включения. После 2 недель культивирования такие клетки присутствовали во всех исследованных образцах. При культивировании МСК в среде, содержащей факторы индукции остеогенной дифференцировки, после 11-х суток клетки начинали формировать матрикс, количество которого постоянно увеличивалось.

Культивирование МСК в среде для хондрогенной дифференцировки в течение 7 дней приводило к появлению в популяции клеток, экспрессирующих коллаген 2 типа. Через 2 недели более 60% МСК в культурах, полученных из костного мозга и жировой ткани окрашивались альциановым синим(рисунок 10).

Рисунок 10. Вид культур МСК жировой ткани через 2 недели культивировании в стандартной культуральной среде (А) и в среде, содержащей хондрогенные (Б, окрашивание альциановым синим), адипогенные(В, окрашивание жировым красным) и остеогенные стимулы (Г, окрашивание ализариновым красным). Световая микроскопия.

Иммунофенотип МСК

Одной из основных характеристик МСК является иммунофенотип. Нами было проведено сравнение иммунофенотипа первичных культур МСК, полученных из образцов костного мозга и жировой ткани. Анализ проводили на 2 и 3 пассаже, определяя следующие поверхностные антигены: CD90+, CD105+, CD44+, CD10+, CD13+, CD73+, CD45+, CD34+, CD117, CD14. Все культуры на момент анализа находились в логарифмической фазе роста, конфлюентность была в пределах 50-75%.

Процентное содержание клеток, положительных по экспрессии поверхностных антигенов CD90, CD105, CD44, CD73, и отрицательных по экспрессии СD45, CD34, CD117, CD14, в культурах МСК, полученных из разных источников, было схожим и превышало 90%, что указывает на однородность всех проанализированных культур по экспрессии этих антигенов. Наибольшая вариабельность наблюдалась по экспрессии CD13 (аминопептидаза N) СD10 (нейтральная эндопептидаза) в культурах МСК костного мозга на втором пассаже. При дальнейшем культивировании (начиная с 3 пассажа) CD10 и CD13 экспрессировали 83±10% и 71±12, 5 клеток (таблица 2).

Таблица 2 - Доля клеток экспрессирующих указанные поверхностные антигены в культурах МСК (2 пассаж), полученных из разных источников.

Источник МСК Антиген	Жировая ткань	Костный мозг
Гипоксия	нормоксия	гипоксия	нормоксия
CD90+	99, 3±0, 4	99±0, 2	99±0, 4	98, 6±1, 4
CD105+	99±0, 8	99, 5±0, 3	99, 3±0, 5	98, 7±1, 1
CD73+	98, 2±0, 6	99, 1±0, 4	90±6, 2	94, 5±5
CD10+	81±13, 5	75, 8±19, 2	98±0, 9	86, 3±7, 1
CD13+	97, 3±2, 1	90, 5±5, 6	96, 1±1, 9	92, 4±6, 3
CD44+	99, 8±0, 5	98, 7±0, 4	97, 5±2, 3	98, 2±0, 8
HLA-ABC	99, 8±0, 1	99, 7±0, 3	99, 2±0, 1	99, 4±0, 4
CD45-	2, 5±1, 2	1, 9±1, 3	1, 9±1, 6	2, 4±2, 2
CD14-	2, 4±1, 6	2, 5±1, 9	1, 5±0, 8	1, 1±0, 1
CD117-	1, 8±0, 5	2, 3±1, 1	1, 1±0, 4	0, 7±0, 6
CD34-	3, 4±2, 1	3, 2±2, 6	3, 1±2, 8	2, 7±1, 7

Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходный иммунофенотип. Исключением является показатель средней интенсивности флоуресценции клеток, экспрессирующих CD90. Оценка средней интенсивности флоуресценции показала достоверные отличия в уровне экспрессии CD90 между МСК костного мозга, по сравнению с МСК жировой ткани.

МСК, выделенные из разных источников, могут отличаться по уровню экспрессии CD105. Средняя интенсивность флоуресценции МСК жировой ткани, является достаточно постоянной в различных культурах (рисунок 11). Индивидуальная вариабельность культур МСК костного мозга и жировой ткани, затрудняет определение влияния тканевого происхождения клеток на экспрессию CD105.

Рисунок 11. Средняя интенсивность флоуресценции МСК из разных источников, экспрессирующих антиген CD105. Указаны стандартные отклонения.

Таким образом, МСК из различных источников, имеют в целом сходный иммунофенотип, но существует различия в экспрессии CD10, CD13, CD105 и CD90.

⇐ Предыдущая 1 2 34