Гусева Анастасия Владимировна

Выполнила студентка 1 курса 112 группы

Лечебного факультета

Гусева Анастасия Владимировна

Проверила: ассистент кафедры

Литвинова Наталья Сергеевна

Тюмень, 2017 г.

Drug resistance mediating Plasmodium falciparum polymorphisms and clinical presentations of parasitaemic children in Uganda

Abstract

Background

Plasmodium falciparum genetic polymorphisms that mediate altered drug sensitivity may impact upon virulence. In a cross-sectional study, Ugandan children with infections mutant at pfcrt K76T, pfmdr1 N86Y, or pfmdr1 D1246Y had about one-fourth the odds of symptomatic malaria compared to those with infections with wild type (WT) sequences. However, results may have been confounded by greater likelihood in those with symptomatic disease of higher density mixed infections and/or recent prior treatment that selected for WT alleles.

Methods

Polymorphisms in samples from paired episodes of asymptomatic and symptomatic parasitaemia in 114 subjects aged 4–11 years were followed longitudinally in Tororo District, Uganda. Paired episodes occurred within 3–12 months of each other and had no treatment for malaria in the prior 60 days. The prevalence of WT, mixed, and mutant alleles was determined using multiplex ligase detection reaction-fluorescent microsphere assays.

Results

Considering paired episodes in the same subject, the odds of symptomatic malaria were lower for infections with mutant compared to WT or mixed sequence at N86Y (OR 0.26, 95% CI 0.09–0.79, p = 0.018), but not K76T or D1246Y. However, symptomatic episodes (which had higher densities) were more likely than asymptomatic to be mixed (for N86Y OR 2.0, 95% CI 1.04–4.0, p = 0.036). Excluding mixed infections, the odds of symptomatic malaria were lower for infections with mutant compared to WT sequence at N86Y (OR 0.33, 95% CI 0.11–0.98, p = 0.046), but not the other alleles. However, if mixed genotypes were grouped with mutants in this analysis or assuming that mixed infections consisted of 50% WT and 50% mutant genotypes, the odds of symptomatic infection did not differ between infections that were mutant or WT at the studied alleles.

Conclusions

Although infections with only the mutant pfmdr1 86Y genotype were associated with symptomatic infection, this association could primarily be explained by greater parasite densities and therefore greater prevalence of mixed infections in symptomatic children. These results indicate limited association between the tested polymorphisms and risk of symptomatic disease and highlight the value of longitudinal studies for assessing associations between parasite factors and clinical outcomes.

Keywords

Malaria Plasmodium falciparum Drug resistance Virulence Fitness Uganda

Background

Malaria, in particular infection caused by Plasmodium falciparum, remains an overwhelming problem in most of sub-Saharan Africa.Malaria control is greatly limited by drug resistance. Resistance to a number of drugs is mediated in part by polymorphisms in two putative drug transporters, encoded by the pfcrt and pfmdr1 genes. The pfcrt 76T mutation is the major mediator of resistance to chloroquine and amodiaquine. Polymorphisms in pfmdr1 impact upon sensitivity to a number of drugs. Considering polymorphisms that are common in Africa, the pfcrt 76T and pfmdr1 86Y and 1246Y mutations are associated with decreased sensitivity to chloroquine and amodiaquine, but these same mutations mediate increased sensitivity to lumefantrine and mefloquine.

The effects of drug resistance mediating genetic polymorphisms on the fitness and virulence of malaria parasites is of interest. Considering fitness, discontinuation of chloroquine for the treatment of malaria has led to dramatic changes in circulating parasites, with the return of chloroquine-sensitive pfcrt K76 wild type (WT) parasites and also of strong anti-malarial efficacy for chloroquine. Clearly, chloroquine-sensitive parasites with WT sequence at pfcrt have a fitness advantage over resistant parasites. Considering pfmdr1, WT parasites outgrew those with three mutations, only one of which (1246Y) is common in Africa, in in vitro competition experiments. Following mixed clinical isolates in culture over time, modest fitness advantages appeared associated with the mutant 86Y and WT D1246 alleles. In an area with seasonal malaria, the prevalence of parasites with mutant pfcrt 76T and pfmdr1 86Y sequences decreased during the low transmission season, when drug pressure is lowest, implying a fitness advantage for WT parasites. Overall, in most cases parasites with WT sequences in pfcrt and pfmdr1 have appeared to have a fitness advantage over mutant parasites.

It is unclear if P. falciparum drug resistance-mediating polymorphisms also impact on parasite virulence, characterized as the ability to cause symptomatic or severe disease. Studies from India and Mali, but not Sudan or Gabon, showed associations between presence of the pfcrt 76T mutation and severe malaria, but these associations may have been due to clinical progression after chloroquine treatment failure, rather than variations in parasite virulence. Previously, differences in genotypes between parasites causing symptomatic and asymptomatic infections were studied in samples from a cross-sectional study of children from Tororo, Uganda. Remarkably, children harbouring isolates with mutations at pfcrt K76T, pfmdr1 N86Y, or pfmdr1 D1246Y had about one-fourth the odds of symptomatic malaria compared to those with WT parasites. Similarly, in children in Benin, the prevalence of the pfmdr1 86Y mutation was significantly greater in asymptomatic compared to symptomatic infections, consistent with decreased virulence of parasites with the pfmdr1 86Y mutation. However, the results of these case–control studies may have been confounded by two factors. First, infections associated with symptomatic disease typically have greater parasite densities than those that are asymptomatic, increasing the likelihood of detecting WT genotypes present in mixed infections. Second, children with symptomatic infection may have had a greater likelihood, compared to children presenting with asymptomatic infection, of a recent prior infection treated with artemether/lumefantrine, which selects for WT alleles. To further explore relationships between parasite genotype and clinical presentation, samples were utilized from an ongoing longitudinal study and genotypes were compared for parasites in paired samples from Ugandan children with symptomatic and asymptomatic episodes of malaria.

Methods

Longitudinal study

Samples were collected from children enrolled in a cohort study in Nagongera Sub-county, Tororo District, Uganda, an area of high malaria transmission intensity. The cohort study has been described previously. In brief, all households within the sub-county were enumerated and mapped, and 100 randomly selected households were enrolled if they met enrollment criteria of having at least one resident 0.5–10 years of age and at least one adult who provided informed consent. Subjects were encouraged to visit a dedicated study clinic open seven days a week for any illnesses. Febrile subjects (temperature ≥ 38 °C tympanic or history of fever in the past 48 h) were evaluated at the clinic, and if malaria was diagnosed based on any level of parasitaemia on a Giemsa-stained thick smear, treatment (artemether–lumefantrine for uncomplicated malaria; quinine for complicated malaria) was provided. Subjects also had routine blood smears obtained every 3 months. At the time of blood collection either for symptomatic disease or at routine visits, blood was also spotted onto filter paper and stored. The cohort study was approved by the Makerere University School of Medicine Research and Ethics Committee, the Uganda National Council for Science and Technology, and the University of California, San Francisco Committee on Human Research.

Statistical methods

Data analysis was done using R version 3.3. The primary outcome was presentation with symptomatic vs. asymptomatic malaria infection. Comparisons of the odds of genotypes present in symptomatic vs. asymptomatic paired isolates was performed grouping mixed infections as mutant, mixed infections as WT, excluding mixed infections from the analysis, or considering mixed samples as consisting of 50% WT and 50% mutant parasites. Analyses were performed using a binomial generalized estimating equations model, to allow for correlation between paired samples from each individual. A p value < 0.05 was considered statistically significant.

Происхождение

Генетические полиморфизмы Plasmodium falciparum, которые опосредуют измененную чувствительность к препарату, могут влиять на вирулентность. В перекрестном исследовании угандийские дети с инфекционными мутантами у pfcrt K76T, pfmdr1 N86Y или pfmdr1 D1246Y имели примерно одну четверть шансов симптоматической малярии по сравнению с теми, у которых были инфекции с диким типом (WT). Однако результаты могли быть сбиты с большей вероятностью у пациентов с симптоматическим заболеванием смешанных инфекций с высокой плотностью или недавней предшествующей обработкой, которая была выбрана для аллелей WT.

Методы

Полиморфизмы в образцах из парных эпизодов бессимптомной и симптоматической паразитемии у 114 испытуемых в возрасте 4-11 лет наблюдались в Торожском районе, Уганда. Парные эпизоды произошли в течение 3-12 месяцев друг от друга и не имели лечения малярии в предшествующие 60 дней. Распространенность WT, смешанных и мутантных аллелей определяли с помощью тестов реакции детектирования мультиплексной лигазы - флуоресцентные микросферы.

Результаты

Учитывая парные эпизоды у одного и того же субъекта, вероятность симптоматической малярии была ниже при инфекции с мутацией по сравнению с WT или смешанной последовательностью при N86Y (OR 0, 26, 95% CI 0, 09-0, 79, p = 0, 018), но не K76T или D1246Y. Тем не менее, симптоматические эпизоды (с более высокой плотностью) были более вероятными, чем бессимптомные, которые могли быть смешаны (для N86Y OR 2.0, 95% CI 1, 04-4, 0, p = 0, 036). Исключая смешанные инфекции, шансы симптоматической малярии были ниже для инфекций с мутацией по сравнению с последовательностью WT при N86Y (OR 0, 33, 95% CI 0, 11-0, 98, p = 0, 046), но не других аллелей. Однако, если смешанные генотипы были сгруппированы с мутантами в этом анализе или предполагали, что смешанные инфекции состоят из 50% WT и 50% мутантных генотипов, шансы симптоматической инфекции не различались между инфекциями, которые были мутантами или WT в изученных аллелях.

Выводы.

Хотя инфекции только с мутантным генотипом pfmdr1 86Y ассоциировались с симптоматической инфекцией, эту ассоциацию можно объяснить в первую очередь большей плотностью паразита и, следовательно, большей распространенностью смешанных инфекций у детей с симптомами. Эти результаты указывают на ограниченную связь между тестируемыми полиморфизмами и риском симптоматической болезни и подчеркивают ценность продольных исследований для оценки ассоциаций между паразитическими факторами и клиническими исходами.

Предпосылка

Малярия, в частности инфекция, вызванная Plasmodium falciparum, остается подавляющей проблемой в большинстве стран Африки к югу от Сахары. Борьба с малярией сильно ограничена лекарственной устойчивостью. Сопротивление ряду лекарств частично опосредуется полиморфизмами в двух предполагаемых переносчиках наркотиков, закодированных генами pfcrt и pfmdr1. Мутация pfcrt 76T является основным медиатором устойчивости к хлорохину и амодиакину. Полиморфизмы в pfmdr1 влияют на чувствительность к ряду препаратов. Учитывая распространенные в Африке полиморфизмы, мутации pfcrt 76T и pfmdr1 86Y и 1246Y ассоциированы с пониженной чувствительностью к хлорохину и амодиакину, но эти же мутации обеспечивают повышенную чувствительность к люмефантрину и мефлохину.

Представляет интерес воздействие лекарственной устойчивости, опосредующей генетические полиморфизмы на пригодность и вирулентность малярийных паразитов. Учитывая пригодность, прекращение использования хлорохина для лечения малярии привело к резким изменениям в циркулирующих паразитах, с возвратом чувствительных к хлорохину паразитов P76 и дикого типа (WT), а также сильной противомалярийной эффективности для хлорохина. Ясно, что чувствительные к хлорохину паразиты с последовательностью WT у pfcrt имеют преимущество в отношении пригодности по сравнению с резистентными паразитами. Учитывая pfmdr1, паразиты WT переросли тех, у кого три мутации, только одна из которых (1246Y) распространена в Африке, в экспериментах по конкуренции in vitro. После смешанных клинических изолятов в культуре с течением времени появились скромные преимущества пригодности, связанные с аллелями 86Y и WT D1246 мутантов. В районе с сезонной малярией распространенность паразитов с последовательностями мутантных pfcrt 76T и pfmdr1 86Y снижалась в течение низкого сезона передачи, когда давление препарата было самым низким, что подразумевало преимущество пригодности для паразитов WT. В целом, в большинстве случаев паразиты с последовательностями WT у pfcrt и pfmdr1, по-видимому, имеют преимущество в отношении пригодности по сравнению с паразитами-мутантами.

Неясно, оказывают ли полиморфизмы, резистентные к лекарственному средству P. falciparum, также воздействие на вирулентность паразита, характеризующуюся как способность вызывать симптоматическое или тяжелое заболевание. Исследования, проведенные в Индии и Мали, но не Судане или Габоне, показали связь между наличием мутации pfcrt 76T и тяжелой малярией, но эти ассоциации, возможно, были обусловлены клинической прогрессией после лечения хлорохином, а не вариацией в вирулентности паразитов. Рание различия в генотипах между паразитами, вызывающими симптоматические и бессимптомные инфекции, изучались в образцах поперечного исследования детей из Тороро, Уганда. Примечательно, что у детей, укрывавших изоляты с мутациями у pfcrt K76T, pfmdr1 N86Y или pfmdr1 D1246Y, примерно одна четвертая вероятность симптоматической малярии по сравнению с детьми с паразитами WT. Аналогичным образом, у детей в Бенине распространенность мутации pfmdr1 86Y была значительно выше при асимптоматическом сравнении с симптоматическими инфекциями, что согласуется с уменьшением вирулентности паразитов с мутацией pfmdr1 86Y. Тем не менее, результаты этих исследований контроля случай-контроль, возможно, были скомпрометированы двумя факторами. Во-первых, инфекции, связанные с симптоматическим заболеванием, как правило, имеют большую плотность паразита, чем те, которые являются бессимптомными, увеличивая вероятность обнаружения генотипов WT, присутствующих в смешанных инфекциях. Во-вторых, дети с симптоматической инфекцией, возможно, имели большую вероятность по сравнению с детьми с бессимптомной инфекцией недавнего предшествующего инфицирования, обработанного артеметер / лумефантрином, который выбирает аллели WT. Для дальнейшего изучения взаимосвязи между генотипом паразитов и клинической картиной были использованы образцы из продолжающегося продольного исследования, а генотипы сравнивались у паразитов в парных образцах угандийских детей с симптоматическими и бессимптомными эпизодами малярии.

Методы

Длительное обучение

Образцы были взяты у детей, включенных в когортное исследование в субконфессиональном округе Нагонгера, округ Тороро, Уганда, в районе высокой интенсивности передачи малярии. Когортное исследование было описано ранее. Вкратце, все домохозяйства в суб-округе были перечислены и составлены на карту, и 100 случайным образом отобранных домашних хозяйств были зачислены, если они соответствовали критериям регистрации, по крайней мере, одного резидента в возрасте 0, 5-10 лет и по крайней мере одного взрослого, который предоставил информированное согласие. Субъектам было предложено посетить специализированную учебную клинику, открытую семь дней в неделю для лечения любых заболеваний. В клинике оценивались лихорадочные предметы (температура барабанной перепонки 38 ° C или история лихорадки за последние 48 часов), и если диагноз малярии был основан на любом уровне паразитемии на окрашенном Гимзе губном мазке, лечение (артеметер-люмефантрин для Неосложненной малярии, хинин для осложненной малярии). Субъекты также получали обычные мазки крови каждые 3 месяца. Во время сбора крови либо при симптоматическом заболевании, либо при регулярных визитах, кровь была также на фильтровальной бумаге и хранилась. Когортное исследование было одобрено исследовательским и этическим комитетом Университета Макерере, Национальным советом по науке и технике Уганды и Калифорнийским университетом в Сан-Франциско.

Статистические методы

Анализ данных проводился с использованием версии R 3.3. Основным результатом было представление с симптоматической или бессимптомной инфекцией малярии. Сравнения шансов генотипов, присутствующих в симптоматическом или бессимптомном парном изоляте, проводили, группируя смешанные инфекции как мутанты, смешанные инфекции как WT, исключая смешанные инфекции из анализа, или рассматривая смешанные образцы как состоящие из 50% WT и 50% мутантных паразитов. Анализы проводились с использованием модели биномиальных обобщенных оценочных уравнений, чтобы обеспечить корреляцию между парными выборками от каждого индивидуума. Значение р < 0, 05 считалось статистически значимым

Результаты

Кафедра биологии

Перевод статьи

Выполнила студентка 1 курса 112 группы

Лечебного факультета

Гусева Анастасия Владимировна