Особенности генетики микроорганизмов (бактерий)

Стр 1 из 3Следующая ⇒

Особенности генетики микроорганизмов (бактерий)

- наука о закономерностях наследственности и изменчивости микроорганизмов.

Наследственность – способность передавать признаки и свойства м/о от одних поколений

другим.

Единица наследственности – ген

Ген – участок молекулы нуклеиновой кислоты (как правило ДНК/у бактерий/, РНК /у некото

рых вирусов/, несущий информацию о специфической структуре 1 белка.

Нуклеиновые кислоты – линейные биополимеры, состоящие из мономеров- нуклеотидов.

Геном – совокупность генов нуклоида.

Генотип – совокупность генов нуклеоида и плазмид.

У всех живых микроорганизмов 2 типа нуклеиновых кислот:

1) ДНК (Дезоксирибонуклеиновая кислота)

-длинная 2-цепочечная молекула, закрученная в спираль. Универсальный носитель генетической информации, которая записана с помощью генетического кода азотис-

тых оснований (аденин, гуанин, цитозин и тимин /А, Г, Ц, Т/ )

Представляет собой биополимер, который состоит из нуклеотидов.

ДНК имеет первичную и вторичную структуру:

а) Первичная стуктура – линейная последовательность нуклеотидов.

Нуклеотид состоит в свою очередь из одного из азотистых оснований, дезоксирибозы и остатка фосфорной кислоты.

б) Вторичная структура – это 2 комплементарные нити ДНК, закрученные в двойную

спираль.

Эти нити комплементарны и антипараллельны.

Свойства ДНК:

А) Уникальная способность к cамовоспроизведению-репликации.

-способность к построению второй комплементарной цепи на матрице 1 из цепей.

Т.о. на матричной цепи строится дочерняя по принципу комплементарности при

помощи фермента ДНК-зависимой ДНК-полимеразы.

Б) Принцип комплементарности

Напротив Аденина в одной цепи в другой цепи всегда стоит Тимин

Напротив Гуанина в одной цепи в другой цепи расположен Цитозин.

Таким образом дочерняя нить ДНК является зеркальным отображением материнс-

кой (матричной ) ДНК

В) Способность к денатурации при 95⁰ С.

Денатурация –потеря вторичной структуры ДНК, проявляющаяся в расхождении

2-х цепей. При понижении температуры ДНК восстанавливает свою двойную спи-

раль.

Г) Антипараллельность двух нитей ДНК: 1 нить – 3^’-5^’

2 нить –5^’-3^’

Принцип строения ДНК универсален для всего живого, но у разных видов ДНК

Отличается по длине, по составу и последовательности оснований нуклеотидов.

Функция: Хранение, воспроизведение и передача генетической информации.

Вся генетическая информация уникальна и не повторяется.

Реализация в течение всей жизни клетки в виде синтеза белков.

Перед синтезом белка двойная спираль ДНК раскручивается и ее нити расходятся, на

одной из нитей ДНК(матричной) происходит синтез информационной РНК (транскрипция)

2) РНК (Рибонуклеиновая кислота)

Отличия от ДНК:

- Имеет только первичную структуру – линейная последовательность нуклеотидов.

- В составе нуклеотида вместо дезоксирибозы- рибоза.

- Также состоит из 4 азотистых оснований, но взамен тимина- урацил:

А- У

Г- Ц

- РНК в отличие от ДНК – короткоживущий компонент клетки, выявление рРНК

методом NASBA-ПЦР позволяет выявить жизнеспособныевозбулители.

-У бактерий 3 типа РНК:

· информационная РНК

«Информационный посредник» между ДНК нуклеоида и рибосомой.

· транспортная РНК

В процессе синтеза белка поставляет аминокислоты к рибосомам согласно

информации, записанной на информационной РНК.

· рибосомальная РНК.

Входит в состав рибосом-органоидов, на которых происходит синтез белка из

отдельных аминокислот по заданной иРНК матрице.(программе)- трансляция.

-У вирусов 2 типа РНК: геномная +РНК и геномная - РНК

+РНК является информационной РНК и напрямую участвует в синтезе белка.

- РНК не является информационной РНК, на ее матрице синтезируется копия ДНК

при помощи фермента обратной транскриптазы (ревертазы).

Для большинства вирусов РНК выполняет функцию хранения генетической информации взамен ДНК.

Схема реализации генетического кода:

Ген (ДНК) -^{транскрипция}-РНК -^{трансляция}--белок (фермент/структурный белок) ------признак (наличие жгутика, токсина, адгезинов)

Особенности генетики бактерий:

-1 кольцевиднозамкнутая 2-х цепочечная молекула ДНК (нуклеоид)/1 «хромосома»/

- ДНК бактерий имеет только первичную и вторичную структуру, в отличие

От эукариот, у которых имеется третичная структура.

-Все гены находятся в постоянной активности на 95%( у эукариот 10% генов)

- Наличие внехромосомных ДНК –плазмид, которые могут передаваться от одной клетке к другой в процессе конъюгации( Плазмиды вирулентности, R-плазмиды).Могут находится свободно (неактивны) и быть встроенными хромосому-эписома (активны).

- Наличие трех типов РНК как и эукариот (иРНК, тРНК, рРНК)

Практическое применение.

Уникальные свойства нуклеиновых кислот, а именно способность к репликации,

денатурации и восстановлению своей вторичной структуры, транскрипции и тран-

сляции легли в основу разработок молекулярно-генетических методов диагностики

заболеваний человека, в том числе инфекционного генеза.

Генетические (Молекулярно-биологические) методы

Диагностики инфекционных заболеваний.

Основаны на обнаружении нуклеиновых кислот(ДНК, геномной РНК, рибосомальной РНК) возбудителя (бактерий, вирусов, простейших) в пробе.

Генетические методы:

1) Гибридизационные

2) Амплификационные методы:

- ПЦР (полимеразная цепная реакция)

- Лигазная реакция

- Методы транскрипционно-опосредованной амплификации (NASBAПЦР)

Основной и наиболее распространенный метод- ПЦР(Полимеразная цепная реакция)

Основа реакции- способность ДНК к самопроизведению.

Позволяет увеличить число копий искомого специфического участка ДНК бактерий и вирусов в миллионы раз с использованием ДНК-полимеразы, нуклеотидов, праймеров, буфера и специального оборудования(амплификатора)

1) Пробоподготовка исследуемого материала:

-центрифугирование (кровь, моча, ликвор, фекалии)

-гомогенизация

2) Экстракция нуклеиновых кислот (Нуклеовыделение) ДНК, РНК, рибосомальнойРНК:

Разрушение оболочек эпителиальных клеток, оболочек бактерий и вирусов, уда-

ление белков, ингибиторов ПЦР (белки, ДНК-аза) с последующим осаждением

и элюцией нуклеиновых кислот в раствор.

- Термолизис (Экспресс-метод, ведущий к потери части ДНК, не подходит для

выделения РНК)

-Осаждение

-Осаждение с магнитным штативом.

При любом способе нуклеовыделение проводится в присутствии ВКО-внутренне-

го контрольного образца (ген глобина человека, который добавляется в пробирку)

Нуклеовыделение проводится в пробирках с применением хаотропных агентов, осадителей, отмывочных растворов и элюирующих растворов.

Нуклеовыделение от 15 мин до 2 часов, в зависимости от количества образцов и

способа экстракции. Проводится вручную или автоматически (пр «EasyMaq»)

3) Амплификация - многократное увеличение числа копий специфического участка

ДНК.

Амплификация проводится на специальных приборах-амплификаторах(термоцик-

лерах) и амплификаторах с детекцией флуоресцентного сигнала.

Данные приборы позволяют резко изменять температуру согласно протоколу иссле-

дования:

2 типа приборов:

а) Планшетного типа (СFX-96, ICyqler 5)

б) Роторного типа (RottorGen)

Компоненты реакции ПЦР:

1) Искомая ДНК образца (хромосомная, плазмидная), или РНК (геномная, рибосо -мальная),

2) Праймеры -олигонуклеотиды (10-30 азотистых оснований), содержащие компле-

ментарную последовательность ДНК к границе специфического участка искомой

ДНК.

При отсутсвии такого участка праймер не прикрепится и ПЦР не начнется.

Термостабильная ДНК-зависимая ДНК-полимераза (TaqF)

Данный фермент выдерживает колебания высоких температур на всех этапах

амплификации.Активный синтез копий ДНК при температуре 70-72⁰ С.

Cмесь нуклеотидов с различными азотистыми основаниями.(А, Г, Ц, Т)

Из нуклеотидов фермент ДНК-полимераза синтезирует копию ДНК.

Олигоуклеотиды-зонды, меченыефлуорофорами (FAM, HEXи пр.) и гасите-

лем.Только для варианта ПЦР в реальном времени (Real-TimePCR)

Cолевой буферный раствор.

Cодержит соли магния для работы полимеразы.

7) Ревертаза (Обратная транскриптаза) –только ПЦР-диагностики вирусных

И т.д.

В среднем от 20 до 45 циклов ( в Real-TimePCRобычно 45)

Рост в геометрической прогрессии на последних циклах замедляется – «

эффект плато», на что влияет утилизация праймеров, нуклеотидов, полимеразы, количество ингибиторов(праймеров-димеров, конкурирующих за полимеразу); неполная денатурация при высокой концентрации специфичес-

ких продуктов.

Время амплификации 1, 5-2, 5 часа.

Для РНК-содержащих вирусов амплификации предшествует этап обратной транскрипции

(ОТ) 50⁰ С, продолжительность 30 мин.

· Детекция продуктов ПЦР

По способу детекции выделяют следующие варианты ПЦР:

НК.

Методы выделения ДНК и РНК

Цель экстракции:

-Удаление белков, ДНК или РНК

- Изоляция специфического типа ДНК (или РНК)

Основные требования:

- Низкая трудоемкость

-Быстрота выполнения процедуры

-Максимальное удаление ингибиторов ПЦР

-Минимизация потерь нуклеиновых кислот

- Низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу»

Способы выделения зависят от вида исследуемого материала, от его природы, характера

и свойств выделяемого объекта.

3 этапа:

Разрушение клеток (лизис)

Кипячение, использование хаотропных агентов.

Инактивация нуклеаз

Очистка нуклеиновых кислот

Оборудование.

Термоциклеры- приборы, способные циклически изменять температуру и время на основе

специальной заданной программы.

Амплификаторы отличаются друг от друга системами охлаждения, способами обогрева,

режимами регулирования смены температуры, количеством платформ.

В термоциклере пробирки помещаются в металлический блок, температура которого изме-

няется с помощью элемента Пелтье, который позволяет изменять температуру блока с боль-

шой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.

Современныетермоциклеры приспособлены к использованию тонкостенных пластиковых

пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и дополнительно сократить время проведения реакции.

Регулирование по матрице, при котором заданный в программе температурный профиль

трактуется как температурный профиль термоблока.

Схема амплификации