Тема 8 «Изучение антибиотикочуствительности бактерий. Бактериофаги»

Цель – формирование знаний об антибиотиках и бактериофагах, умений определять ак­тивность антибиотиков, чувствительность и устойчивость бактерий к ним,  делать заключение по изученному материалу, навыков работы с источниками информации, лабораторным оборудованием и инструментами, микробными культурами.

План

1. Изучить методические указания к занятию № 8.

2. Определить чувствительность микробных культур к антибиотикам методом диффузии в агар, отчитаться преподавателю о проделанной работе.

Материальное обеспечение: музейные микробные культуры в пробирках, стерильные среды (МПА, солевой агар) в чашках Петри, стандартные диски с антибиотиками, пробирки со стерильным физ. раствором, спиртовки, инструменты для проведения посева микробных культур.

Теоретический материал

Антибиотики — специфические продукты жизнедеятельности бактерий (в том числе актиномицетов), грибов, растений (фитонциды) и животных, обладающие активностью по отношению к микроорганизмам определенных групп.

Бактериостатическое действие антибиотика – это его способность задерживать рост определенного микроорганизма.

Бактерицидное действие антибиотика – это его способность полностью подавлять жизнедеятельность определенного микроорганизма.

Антибиотики готовят промышленным путем в виде солей натрия, калия, кальция и выпускают в специальных упаковках. При выпуске антибиотика (промышленном или лабораторном) обязателен контроль его активности.

Биологическую активность антибиотиков выражают в единицах действия (ЕД), содержащихся в 1 мл раствора (ЕД/мл) или в 1 мг препарата (ЕД/мг). За одну единицу принимают минимальное количество антибиотика, которое подавляет рост стандартного тест-микроба в строго определенном объеме питательной среды. При установлении активности каждого антибиотика используют определенный для того или иного препарата тест-микроб, обладающий самой высокой чувствительностью к данному антибиотику.

Для определения активности антибиотика чаще используют биологический метод, в основе которого лежит выявление интенсивности воздействия пре­парата на живую микробную клетку.

В ветеринарной практике антибиотики с учетом спектра их действия используют с лечебной целью при некоторых инфекционных болезнях животных. Вначале устанавливают возбудителя болезни проведением бактериологического исследования, а затем проверяют чувствительность (или резистентность) выделенного вида микроба к антибиотикам. Чув­ствительность микроба (возбудителя болезни) к антибиотикам выражается задержкой его роста или гибелью от минимальной концентрации препарата (мкг, ЕД/мл) в тече­ние 16—18 ч.

Чувствительность микроба к антибиотикам проверяют методами:

1) серийных разведений в жидкой или на плотной питательной среде;

2) диффузии в агар с применением дисков, содержащих антибиотики.

Метод серийных разведений включает следующие основные этапы:

· выбор питательных сред,

• приготовление растворов антибиотиков,
• подготовка микробных культур для исследования
• учет результатов.

Питательная среда должна обеспечивать оптимальный рост культуры микроба (возбудителя болезни).

В жидкой среде при определении чувствительности одного штамма микроба к одному антибиотику необходимо иметь шесть пробирок с 2 мл среды в каждой (для серийного разведения антибиотика), две пробирки по 9—10 мл среды для разведения куль­туры микроба и колбу с питательной средой для приготовления рабочего раствора антибиотика. Сначала готовят его основной раствор (используя также стандарты антибиоти­ков определенной активности) из расчета 1000 мкг антибиотика в 1 мл растворителя (дистиллированной воды, буферного раствора). Рабочие растворы готовят на питательной среде из основного раствора методом последовательных двукратных разведений, чтобы в 1 мл среды концентрация антибиотика была соответственно, начиная с первой пробирки,—0,25; 0,12; 0,06; 0,03; 0,015; 0,007 мкг.

При использовании плотной среды рабочие разведения антибиотиков готовят в шести пробирках так, чтобы количество препарата в первой пробирке было 400, во второй — 200, в третьей — 100, в четвертой — 50, в пятой — 25 и в шестой — 12,5 мкг/мл. Из каждой пробирки по 1 мл разведенного антибиотика стерильной пипеткой переносят в чашку Петри и добавляют в нее 19 мл расплавленного (и охлажденного до 55 °С) МПА, вращательными движениями смешивают и оставляют на столе до затвердения среды. Концентрация препарата в чашках Петри становится в 20 раз ниже, чем в пробирках (соответственно 20; 10; 5; 2,5; 1,25 и 0,6 мкг/мл).

В ряды пробирок или чашек Петри с питательной средой, содержащие разведенный антибиотик, засевают чистую 16-18-часовую бульонную культуру микроба, выделенную из исследуемого материала, разведенную до концентрации 500 млн микробных тел в 1 мл в соответствии со стандартом мутности. После 16—18-часового инкубирования посевов в термостате при 37 °С учитывают результат. Отмечают пробирку (или чашку), в которой отсутствует рост. Количество антибиотика в ней и последующей пробирке  (чашке), где наблюдается рост бактерий, складывают, выводят среднее арифметическое, которое показывает чувствительность микроорганизма к данному антибиотику. Наличие роста бактерий свидетельствует об их резистентности к данному препарату, а отсутствие роста является по­казателем высокой чувствительности бактерий к антибиотику.

Метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики.

На поверхность плотной питательной среды наливают 1 мл одномиллиардной взвеси (в 0,9 %-ном растворе NaCl) агаровой культуры микроба. Культуру равномерно распределяют по питательной среде шпателем из пастеровской пипетки (газонный посев). Чашки при необходимости подсушивают в термостате 15 мин (37 °С), или при комнатной температуре 30—40 мин. Затем на поверхность засеянной среды стерильным пинцетом накладывают (прижимают) стандартные бумажные диски с разными антибиотиками на расстоянии 2 см от края и друг от друга, один диск — в центре чашки. После наложения каждого диска пинцет следует обжигать на пламени горелки. Сначала чашки выдерживают при комнатной температуре (2 ч), затем, перевернув их вверх дном, помещают в термостат на 16—18 ч при 37 °С. Оценку результатов проводят с учетом наличия или отсутствия зоны задержки роста, размера зоны вокруг диска с антибиотиком. Отсутствие зоны задержки роста бактерий свидетельствует о нечувствительности их к данному препарату. Если проявляется зона задержки роста, ее измеряют по диаметру (включая диаметр диска) с помощью линейки.

Оценка результатов:

· зона задержки до 15 мм является показателем малой чувствительности,

· зона в 15—25 мм указывает на достаточную чувствительность испытуемой бактериальной куль­туры.

Чем больше зона задержки роста бактерий, тем выше их чувствительность к данному препарату.

Стандартные диски с антибиотиками выпускают предприятия медицинской промышленности, Диски хранят в закрытых флаконах в сухом месте при комнатной темпе­ратуре.

Фаги — вирусы определенной формы и структуры. Бактериофаги (фаги) характеризуются своим литическим действием на гомологичные им виды бактерий. Это явление называется бактериофагией (греч. phagein — пожирать). О присутствии фага судят по его специфическому действию на соответствующий вид бактерий. Название фага происходит от названия вида микроба, лизируемого данным фагом (коли-фаг, суипестифер-фаг, сибиреязвенный гамма-фаг и др.). Хотя фаги отличаются специфичностью по отношению к гомологичному виду микроба, но действуют также и на группу родственных видов бактерий. Фаги обладают антигенными свойствами, их используют для гипериммунизации животных с целью получения антифаговых диагностических сывороток. Лизирующее действие фага внешне выражается полным просветлением бульонных культур и образованием прозрачных участков среди сплошного роста бактерий на засеянной поверхности плотной среды (стерильные пятна).

Методика обнаружения фага.

1 В две пробирки с жидкой средой засевают гомологичную фагу бактериальную культуру. В одну из пробирок пастеровской пипеткой вносят, каплю фага. Обе пробирки помещают в термостат. Через 16—18 ч в пробирке, где находился фаг, вследствие лизиса бактерий под его влиянием бульон просветляется. В другой пробирке (без фага) наблюдается обильный рост засеянной культуры.    

2 Обе засеянные пробирки ставят в термостат, через 4-6 ч роста культуры при четко выраженном помутнении среды в одну из пробирок вносят каплю специфического фага и обе пробирки вновь ставят в термостат и учитывают результат через 16—18 ч (после первоначального посева). В пробирке с фагом среда просветляется, а без фага — она становится еще более мутной (обильный рост культуры).

3 Для выявления действия фага на плотной среде бульонную культуру высевают на агар в чашках Петри: 1 каплю культуры растирают стеклянным шпателем по всей поверхности агара, крышку закрывают, чашки помещают в термостат на 3—4 ч. Затем в одну чашку на агаре с молодой культурой вносят фаг по одной капле в нескольких местах и вновь чашки ставят в термостат на сутки. По истечении этого времени в контрольной чашке (без фага) обычно наблюдается обильный сплошной рост бактерий по всей поверхности среды; в чашке с добавленным фагом наблюдается задержка роста бактерий в местах нахождения ка­пель с фагом.

Для практических целей фаги серийно производят на биофабриках. Каждая серия фага перед ее выпуском проверяется на активность, то есть проверяют титр фага — это наименьшая концентрация (или наибольшая степень разве­дения), которая способна лизировать гомологичную культуру. Чем выше степень разведения, тем активнее фаг.

Бактериофаги используют:

1) для фагодиагностики возбудителей сибирской язвы, сальмонеллеза и некоторых других (путем обнаружения специфического фага в исследуемом материале и воздействием специфического фага на бактериальную культуру, выделенную из исследуемого материала);

2) для лечения и профилактики инфекционных болезней (сальмонеллез, колибактериоз);

3) для идентификации микробов в объектах внешней среды (сточные воды и др.)

4) методика реакции нарастания титра фага рекомендуется для санитарной оценки воды, молока, почвы и других материалов.

Практическое задание 1: Изучить теоретический материал теме занятия.

Этапы выполнения задания:

1 Изучить понятие и классификацию антибиотиков, бактериофагов.

2 Усвоить методы определения ак­тивности антибиотиков, чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.

3 Усвоить понятие бактериофаги и методы применения бактериофагов в ветеринарии.

4 Законспектировать теоретический материал по теме занятия.

Практическое задание 2: Определить антибиотикочувствительность микробных культур методом диффузии в агар.

Этапы выполнения задания:

1 Засеять микробную культуру на МПА в чашках Петри.

2 Разместить стандартные диски с четырьмя или пятью антибиотиками на поверхность агара, засеянного культурой бактерий. Поместить чашки в термостат для культивирования.

3 На следующем занятии определить зону задержки роста микробов вокруг диска с антибиотиком, сделать заключение и отчитаться преподавателю.

Вопросы и задания для контроля знаний. 1 Что такое антибиотики? 2 Поясните классификация антибиотиков по происхождению, механизму и спектру действия? 3 Назовите единицы измерения активности антибиотиков. 4Какими методами определяют активность антибиотиков? 5 Какими методами определяют чувствительность микробов к разным антибиотикам. 6 К какой группе микроорганизмов относится бактериофаг? 7 С какой целью исполь зуют явление бактериофагии? 8 Что такое колония фага, стерильные пятна фага? 9 Какими свойствами обладают бактериофаги?

Рекомендуемая литература и источники

1. Госманов, Р. Г. Практикум по ветеринарной микробиологии и микологии [Электронный ресурс] : учеб. пособие / Р. Г. Госманов, Н. М. Колычев, А. А. Барсков. – Санкт-Петербург : Лань, 2014. — 397 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=45680

2. Госманов Р. Г. Микробиология [Электронный ресурс] : учебное пособие / Госманов Р. Г., Галиуллин А. К., Волков А. Х. [и др.]. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2011. — 495 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=1546

3. Госманов Р. Г. Микробиология и иммунология [Электронный ресурс] : учебное пособие / Госманов Р. Г., Ибрагимова А. И., А.К. Галиуллин. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2013. — 240 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=12976

4. Кисленко В. Н. Ветеринарная микробиология и иммунология. Практикум + CD [Электронный ресурс] : учебное пособие. — Электрон. дан. — СПб. : Лань, 2012. — 368 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=3815

5. Колычев, Н. М. Ветеринарная микробиология и микология [Электронный ресурс] : учебник / Н. М. Колычев, Р. Г. Госманов. – Санкт-Петербург : Лань, 2014. — 632 с. — Режим доступа: http://e.lanbook.com/books/element.php?pl1_id=39147.

 

⇐ Предыдущая1234567

Поделиться: