Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
Схема исследования на токсичность стафилококка по Г.Н Чистовичу (1969)
Материал исследования Посев на ЖСА - 24 часа при +37°С (лучше на 48 часов при +37°С).
- положительной лецитовителлазной реакцией (радужный венчик и мутная зона вокруг колонии отсев на скошенный МПА +37°С на 24 часа коагулазная проба отсев на чашку с МПА +37°С на 24 часа - плазмоагглютинация +
фаготипаж, антибиотико- чувствительность культуру отбрасывают культуру отбрасывают
Дополнения к схеме. ЖСА - желточно-солевой агар Г.Н. Чистовича элективен для стафилококков в связи с высоким содержанием хлористого натрия (10 %), а добавленный яичный желток (1 на 100 мл МПА) позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков. Поэтому ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар. Реакция плазмоагглютинации: Микробную массу размешать петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1: 4. Образование хлопьев учитывают в течение 30 сек-1 мин. При наличии плазмоагглютинации штаммы считают патогенными. Коагулазная проба развернутая Ассептично взятую кровь обрабатывают 1 -4 % раствором цитрата или 0, 1 % оксалата, для получения плазмы кровь центрифугируют или отстаивают на холоду, отсасывают пипеткой. Плазму по 0, 2-0, 3 мл наливают в стерильные пробирки + 1 петля или 0, 1 мл испытуемой бульонной культуры. Контроль - то же с заведомо патогенным стафилококком. Все пробирки выдерживают в термостате при +37°С. Учет проводят дважды: через 2- 3 часа и 24 часа по свертыванию плазмы и образованию сгустков. Активные культуры дают положительную реакцию уже через 2-3 часа, слабокоагулирующие - в более поздние сроки. Определение фибролизина методом Кристи: Среда Кристи-Чемпена; мясной экстракт, пептон, хлористый натрий, агар, вода, рН=7, 0. Стерилизуют в автоклаве, хранят впрок. Перед опытом растапливают агар, остужают до +50оС, добавляют 20% стерильной плазмы. Прогревают в водяной бане при +70оС в течение 2-5 минут до появления явной мути, разливают в чашки Петри. Испытуемые культуры засевают «пятнами» по 15-20 на чашку. Посевы инкубируют при +37оС. Учет результатов по зонам просветления (лизиса фибрина) вокруг колоний ведут через 14, 24, 48 часов. Для изучения токсигенности стафилококков используют: Метод Илека и Леви (1950) Берут чашки с МПА + 5 % отмытых физиологическим раствором эритроцитов барана (кролика, человека). На поверхность питательной среды по диаметру помещают стерильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сывороткой. Отступив 1-2 мл от края полоски перпендикулярно к ней засевают штрихами исследуемые культуры. Посевы инкубируют при +37оС в течение суток, после чего учитывают результаты; альфа-гемолизин проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой мазка полоски. Он выявляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами; бета-гемолизин на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона которого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовой» токсин и лучше выявляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при +4оС по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не нейтрализуется альфа- антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен; дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой. Приложение № 5 Микробиологическая индикация ботулизма у больных и пищевых объектах: В материалах: - от больного (кровь, рвотные массы, кал. промывные воды желудка), - из органов труппа (печень, желудок и кишечник с содержимым), - в пищевых продуктах. Цели лабораторной диагностики, обнаружение: - ботулинического токсина и определение его типа; -возбудителя ботулизма. Методы исследования:
1. Микроскопический, ориентировочный (окраска по Граму, Ожешко). 2. Бактериологический, основной (в классическом и ускоренном вариантах) с учетом анаэробности. 3.Серологический, серо-биологический, косвенные. Бактериологический метод исследования: Правила отбора материала. Необходимо брать:
готовая продукция (рыбные, овощные, мясные консервы), остатки пищепродуктов, послуживших причиной отравления. Примечание: Каждый материала брать в отдельные, стерильные банки. Последние тщательно закрывать стерильными пробками, крышками. Материал тщательно закрывать стерильными пробками и до исследования хранить на холоде, т.к. ботулинический токсин разрушается при комнатной температуре. Этапы бактериологического исследования:
1. Обнаружение и идентификация ботулинических токсинов: - цитратную кровь, сыворотку без обработки используют для постановки реакции нейтрализации; - кал (20-25) растереть в ступке с 50 мл физиологического раствора; выдержать при комнатной температуре 1-1, 5 часа (для экстрагирования токсина эмульсию профильтровать через ватно-марлевый фильтр и использовать фильтрат в реакции нейтрализации; - пищевые продукты растереть, экстрагировать в физиологическом растворе 1 час., фильтровать через ватно-марлевый фильтр (или центрифугировать при 3000 об/мин. 15-20 мин.). - органы трупа - экстракты из тканей готовят аналогично (§ 1-3) и используют в реакции нейтрализации. Реакция нейтрализации. Для выполнения реакции необходимы:
- 4 мыши (вес 16-18 г), - смесь противоботулиновых сывороток (типы А, В, С /С1, С2/, Е, Д. J. g, в основном А, В, Е).
Опыт Контроль 0, 5-0, 8 мл фильтрата 0, 5-0, 8 мл фильтрата + 0, 2 мл (или центрифугата) смеси сывороток (по 0, 01 мл в/брюшинно каждого типа, содержащих от 50 до 400 ME антитоксических антител). Примечание: перед введением смесь испытуемого материала и антисывороток выдерживают при +18°С 30 минут. Наблюдение - 4 дня. При наличии токсина дыхание учащенное, мышцы расслабленные, причем, брюшная стенка «западает», перед гибелью у мышей появляются судороги, развивается паралич. В случае гибели всех 4 мышей повторить реакцию нейтрализации с разведенным (в 5, 10, 20, 100 раз) экстрактом (или центрифугатом). После гибели животных повторяют
Выдержать 30 мин. при +18оС, ввести в/б 2 мышам по 1 из на каждой пробирки (для каждой сыворотки - отдельный шприц). Учет реакции через 4, 6 часов, 24 и 96 часов. При наличии токсина выживут мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки. Например, если погибнут все мыши, кроме тех, которым введен экстракт с сывороткой типа А, то в материале содержится токсин типа А.
30 минут при комнатной температуре, содержимое пробирок - по 1.0 мл ввести двум мышам в/б. Учет по вышеописанным правилам. Приложение № 6 |
Последнее изменение этой страницы: 2019-04-09; Просмотров: 375; Нарушение авторского права страницы