Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


Схема исследования на токсичность стафилококка по Г.Н Чистовичу (1969)



                                           Материал исследования

Посев на ЖСА - 24 часа при +37°С

(лучше на 48 часов при +37°С).


 


- положительной лецитовителлазной реакцией (радужный венчик и мутная зона вокруг колонии



отсев на скошенный МПА +37°С на 24 часа

коагулазная проба

отсев на чашку с МПА +37°С на 24 часа

- плазмоагглютинация


+


 


фаготипаж,

антибиотико-

чувствительность

культуру

отбрасывают

культуру отбрасывают


 











Дополнения к схеме.

ЖСА - желточно-солевой агар Г.Н. Чистовича элективен для стафилококков в свя­зи с высоким содержанием хлористого натрия (10 %), а добавленный яичный желток (1 на 100 мл МПА) позволяет выявлять лецитовителлазную активность, которая является одним из показателей патогенности стафилококков. Поэтому ЖСА более четко дифференцирует патогенных представителей, чем кровяной агар.

Реакция плазмоагглютинации:

Микробную массу размешать петлей на стекле в каплях цитратной кроличьей или человеческой плазмы, разведенной 1: 4. Образование хлопьев учитывают в течение 30 сек-1 мин. При наличии плазмоагглютинации штаммы считают патогенными.

Коагулазная проба развернутая

 Ассептично взятую кровь обрабатывают 1 -4 % раствором цитрата или 0, 1 % оксалата, для получения плазмы кровь центрифугируют или отстаивают на холоду, отсасыва­ют пипеткой. Плазму по 0, 2-0, 3 мл наливают в стерильные пробирки + 1 петля или 0, 1 мл испытуемой бульонной культуры. Контроль - то же с заведомо патогенным стафилокок­ком. Все пробирки выдерживают в термостате при +37°С. Учет проводят дважды: через 2- 3 часа и 24 часа по свертыванию плазмы и образованию сгустков. Активные культуры дают положительную реакцию уже через 2-3 часа, слабокоагулирующие - в более поздние сроки.

Определение фибролизина методом Кристи:

Среда Кристи-Чемпена; мясной экстракт, пептон, хлористый натрий, агар, вода, рН=7, 0. Стерилизуют в автоклаве, хранят впрок.

Перед опытом растапливают агар, остужают до +50оС, добавляют 20% стериль­ной плазмы. Прогревают в водяной бане при +70оС в течение 2-5 минут до появления яв­ной мути, разливают в чашки Петри. Испытуемые культуры засевают «пятнами» по 15-20 на чашку. Посевы инкубируют при +37оС. Учет результатов по зонам просветления (ли­зиса фибрина) вокруг колоний ведут через 14, 24, 48 часов.

Для изучения токсигенности стафилококков используют:

Метод Илека и Леви (1950)

Берут чашки с МПА + 5 % отмытых физиологическим раствором эритроцитов ба­рана (кролика, человека). На поверхность питательной среды по диаметру помещают сте­рильную полоску фильтровальной бумаги, смоченную альфа-антитоксической сыворот­кой. Отступив 1-2 мл от края полоски перпендикулярно к ней засевают штрихами иссле­дуемые культуры. Посевы инкубируют при +37оС в течение суток, после чего учитывают результаты;

альфа-гемолизин проявляется в виде полного просветления среды вокруг штриха культуры и нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой мазка полоски. Он выяв­ляется на средах с кроличьими и бараньими эритроцитами;

бета-гемолизин на агаре с бараньей кровью дает частичное просветление, зона ко­торого имеет буровато-пурпурный оттенок. Это «тепло-холодовой» токсин и лучше выяв­ляется после дополнительного суточного выдерживания чашек в холодильнике при +4оС по характерному послойному гемолизу бараньих эритроцитов и не нейтрализуется альфа- антитоксической сывороткой. На кроличьих эритроцитах он не активен;

дельта-гемолизин определяется по узкой полоске гемолиза бараньих и кроличьих эритроцитов, не нейтрализуется альфа-антитоксической сывороткой.

Приложение № 5

Микробиологическая индикация ботулизма у больных и пищевых объектах:

В материалах:

- от больного (кровь, рвотные массы, кал. промывные воды желудка),

- из органов труппа (печень, желудок и кишечник с содержимым),

- в пищевых продуктах.

Цели лабораторной диагностики, обнаружение:

               - ботулинического токсина и определение его типа;

-возбудителя ботулизма.

Методы исследования:

 

1. Микроскопический, ориентировочный (окраска по Граму, Ожешко).

  2. Бактериологический, основной (в классическом и ускоренном вариантах) с учетом анаэробности.

3.Серологический, серо-биологический, косвенные.

Бактериологический метод исследования:

Правила отбора материала. Необходимо брать:

  1. Кровь - до введения антитоксической сыворотки. Из вены 6-8 мл в стерильную пробирку, выдержать 20 мин при +37оС. Сгусток отделить от стенок пробирки. Исследовать сыворотку (можно брать кровь в пробирку с 4% раствором лимон­нокислого натрия в соотношении 3: 1).
  2. Промывные воды желудка - 50-100 мл.
  3. Кал-50-60 мл.
  4. Из трупов (стерильно! ). Поверхность органа прижечь раскаленным шпателем, стерильными ножницами вырезать ткань из глубины органа: кусочки печени - 50-60, отрезки тонкого кишечника (с содержимым), кусочки легочной ткани (50-60), кровь-10 мл.
  5. Продукты (не менее 100 мл): сырье для консервирования,

готовая продукция (рыбные, овощные, мясные консервы), остатки пищепродуктов, послуживших причиной отравления.

Примечание:

Каждый материала брать в отдельные, стерильные банки. Последние тщательно закрывать стерильными пробками, крышками.

Материал тщательно закрывать стерильными пробками и до исследования хра­нить на холоде, т.к. ботулинический токсин разрушается при комнатной темпе­ратуре.

Этапы бактериологического исследования:

 

1. Обнаружение и идентификация ботулинических токсинов:

- цитратную кровь, сыворотку без обработки используют для постановки реак­ции нейтрализации;

- кал (20-25) растереть в ступке с 50 мл физиологического раствора; выдержать при комнатной температуре 1-1, 5 часа (для экстрагирования токсина эмульсию профильтровать через ватно-марлевый фильтр и использовать фильтрат в реак­ции нейтрализации;

- пищевые продукты растереть, экстрагировать в физиологическом растворе 1 час., фильтровать через ватно-марлевый фильтр (или центрифугировать при 3000 об/мин. 15-20 мин.).

- органы трупа - экстракты из тканей готовят аналогично (§ 1-3) и используют в реакции нейтрализации.

Реакция нейтрализации.

Для выполнения реакции необходимы:

 

- 4 мыши (вес 16-18 г),

- смесь противоботулиновых сывороток (типы А, В, С /С1, С2/, Е, Д. J. g, в ос­новном А, В, Е).

 

Опыт                    Контроль

0, 5-0, 8 мл фильтрата                          0, 5-0, 8 мл фильтрата + 0, 2 мл

(или центрифугата)                      смеси сывороток (по 0, 01 мл

в/брюшинно                                каждого типа, содержащих от 50

до 400 ME антитоксических антител).

Примечание: перед введением смесь испытуемого материала и антисывороток вы­держивают при +18°С 30 минут.

Наблюдение - 4 дня. При наличии токсина дыхание учащенное, мышцы расслаб­ленные, причем, брюшная стенка «западает», перед гибелью у мышей появляются судоро­ги, развивается паралич.

В случае гибели всех 4 мышей повторить реакцию нейтрализации с разведенным (в 5, 10, 20, 100 раз) экстрактом (или центрифугатом). После гибели животных повторяют

реакцию нейтрализации с моновалентными сыворотками.    

Для определения типа токсина берут 6 рядов пробирок.


Ингредиенты     Проб и р к и    
  1 2 3 4 5 6
1.Фильтрат 2.Антитоксическая сы- 2, 4 2, 4 2, 4 2, 4 2, 4 2, 4
' воротка типа А 0, 6 - - - - -
- ”- типа В - 0, 6 - - - -
- ” - типа С - - 0, 6 - - -
- ” - типа Е - - - 0, 6 - -
- ” - типа F - - - - 0, 6 -
3.Физиологический раствор           0, 6

Выдержать 30 мин. при +18оС, ввести в/б 2 мышам по 1 из на каждой пробирки (для каждой сыворотки - отдельный шприц). Учет реакции через 4, 6 часов, 24 и 96 часов.

При наличии токсина выживут мыши, получившие смесь токсина и гомологичной сыворотки. Например, если погибнут все мыши, кроме тех, которым введен экстракт с сы­вороткой типа А, то в материале содержится токсин типа А.

 

Для определения токсинемии

Ингредиенты

Пробирки

  1 2 3
1. Сыворотка больного 1, 8 1, 8 1, 8
2. Антитоксическая сы­      
воротка типа А      
3. -”- типа Б 0, 4 - -
4. - ” - типа Е   0, 4 -
  - - 0, 4

 

30 минут при комнатной температуре, содержимое пробирок - по 1.0 мл ввести двум мышам в/б.

Учет по вышеописанным правилам.


Приложение № 6


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2019-04-09; Просмотров: 375; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.023 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь