Осіменіння корів-донорів, запліднення та ранні стадії розвитку ембріонів ⇐ ПредыдущаяСтр 6 из 9Следующая ⇒ F2cc У корів, оброблених гонадотропінами на 15-17-й день циклу, охота наступає через 5-5 днів, а при комбінованій стимуляції гонадотропінами та ПГ-р2а в лютеїнову ста­дію циклу — через 75 годин після введення простагландину. При появі у тварин охоти а осіменяють. Приблизно у 10 % донорів статевий цикл буває алібідним, хоча овуляція відбувається. Осіменяють донорів цервікально, з ректальною фіксацією шийки матки, з вико­ристанням стерильних одноразових інструментів. У кожній дозі сперми повинно бути ж менше 50-100 млн рухливих сперміїв. Оскільки охота та овуляція у оброблених гонадотропінами корів розтягується до 56-48 годин, то їх осіменяють 3^4 рази з інтервалами по 10-12 годин. Оброблені гонадотропінами тварини відрізняються підвищеною чутливістю ста­тевих органів до ректальної пальпації та інфекції, тому осіменяти їх слід обережно. Необережні маніпуляції можуть викликати зміщення бахромки яйцепроводу, тоді не зсі яйцеклітини попадають в його просвіт. Крім того, необережна пальпація яєчника ■ ке викликати передчасні розриви передовуляційних фолікулів і вихід недозрілих ЇЙЦЄКЛІТИН. Введені в цервікальний канал спермії звичайно зберігають тут свою живучість до рак діб, проте під впливом гормональних обробок донорів змінюється якість церві-• ільного секрету, а отже і живучість, і запліднююча здатність сперміїв, що потрібно 211 Розділ 7 мати на увазі при осіменінні донорів. Просуваючись поступово в напрямку яйцепро­водів спермії піддаються капацитації та селекції найбільш життєздатних. Яйцеклітини, що попали після овуляції у яйцепровід, рухаються разом з течією рідини в напрямку рога матки. У верхній третині яйцепроводу вони зустрічаються зі сперміями і при сприятливих умовах переважна більшість з них запліднюється. Запліднена яйцеклітина містить подвійний набір хромосом, тому вона називається зиготою. Лімітуючим фактором відповідних змін сперміїв, яйцеклітин і самого за­пліднення є середовище яйцепроводу. Процес дальшого розвитку зиготи полягає перш за все в поділі її ядра, спочатку на дві половинки (два бластомери), тоді на чотири, вісім і т. д., перетворюючись спо­чатку в ембріони, а тоді в плоди. Програма розвитку ембріона закодована в його ДНК. Послідовність та специфіч­ність всіх його змін залежить від часу зняття блокади окремих детермінант, що були раніше в неактивному стані. Кожна нова структура ембріона несе на своїй поверхні нову антигенну інформацію, від якої може залежати гальмування одних та стимуляція інших ділянок. Приблизно через кожних 24 години кількість бластомерів у ембріоні подвоюється. Прозора та жовткова оболонки при цьому деякий час зберігаються, загальний діаметр ембріона залишається таким же, проте кожні наступні бластомери виявляються вдвічі меншими попередніх, чому цей їх поділ ще називають дробленням. Ранні ембріони затримуються 3^4 дні в яйцепроводах, цьому сприяє наявність між яйцепроводом та рогом матки перешийка, що виконує роль адренергічного сфінктера. В постовуляційну стадію під впливом прогестерону та ПГЕ сфінктер розслаблюється. За час перебування ембріонів у яйцепроводі матка за допомогою фагоцитозу звіль­нюється від залишків сперми, бактерій і т. п., в ендометрії відбуваються проліфера-тивні зміни, підвищується активність маткових залоз, формується гістіотроф. На 3-4-й день ембріон переміщається з яйцепроводу у матку - у великої рога­тої худоби на стадії 8-16-ти бластомерів; у свиней- на стадії 4-х бластомерів; ко­бил на стадії бластоцисти. Бластомери в цей час тісно прилягають один до одного у вигляді шовковиці чи тутової ягоди, тому їх називають (ранньою) морулою. Кіль­кість бластомерів збільшується і на 4-5-ту добу - це морула (16-32 бластомери), а на 6-ту-7-му - пізня морула (32-90 бластомерів). На ранніх стадіях розвитку ембріона всі бластомери знаходяться в однакових умо­вах, проте з часом вони диференціюються стосовно до їх локалізації, дещо змінюєть­ся темп їх дроблення. Із зовнішнього шару бластомерів, що діляться дещо швидше, формується живильний шар - трофобласт, що дасть початок судинній оболонці, а з розміщеного в центрі грудки бластомерів, що діляться повільніше, - ембріобласт, з якого з часом - розів'ється власне зародок (ембріон, а згодом плід) з водною та сечо­вою оболонками. На 7-8-му добу між трофобластом та ембріобластом з'являється щілина, наповне­на рідиною - бластоцель, навколо якої перегруповуються бластомери: більші з них (ембріобласт) зосереджуються на одному полюсі, а дрібніші - на протилежному. Ран- 212 Трансплантація ембріонів ня бластоциста містить від 90 до 120-ти бластомерів, поверхня клітинної маси гладенька, рівномірна, товщина прозо­рої оболонки - біля 12 мк. В наступні дні відбувається даль­ше збільшення кількості бластоме­рів до 300-^-80 на стадії бластоцисти і 1 200-1 500 на стадії пізньої бластоцис­ти. Дещо збільшується їх діаметр (до 140-200 мк), тоншає прозора оболонка, розширюється порожнина бластоцисти, вона займає всю прозору оболонку і на­решті на 9-11-ту добу прозора оболонка лопається (денудація) і ембріон " вилу­плюється". У овець це буває на 7-8-му, свиней - на 6-ту добу розвитку ембрі­она. Незабаром після денудації зарод­ка відбувається обширна проліферація тг> офобласта і помітний ріст в довжину бластоцисти. Такий зародок може три­валий час вільно переміщуватися в про­світі матки, змінюючи поступово свій розмір і форму. З 16-17-го дня у великої рогатої худоби розпочинається імплан­тація зародка. Отже, найбільш придатним для ви­бивання періодом розвитку ембріона є Р-Я-н день, коли він ще захищений про-: орою оболонкою. Рис. 43. Запліднення і ранні стадії розвитку ембріона у яйцепроводі самки: 1 - фолікул, що овулював; 2 - яйцеклітина, оточена про­меневим вінцем; 3 - розсіювання променевого вінця; 4 - проникнення спермія крізь прозору оболонку; 5 - ста­дія двох пронуклеусів; 6 - зигота; 7—9 - стадії двох, чоти­рьох та восьми бластомерів. 7.6. Методи видобування ембріонів Ефективність трансплантації ембріонів у значній мірі залежить від досконалості посованого методу видобування їх з геніталій донора. Із сказаного вище можна: " йти висновок, що на 4-5-ту добу основна кількість ембріонів у великої рогатої • ~оби попадає в ріг матки. Проте суперовуляція значно розтягується в часі і не всі іріони одночасно з'являються у розі матки, частина з них може затримуватися в Ьшроводі до 8-го дня. Поступово ембріони переміщаються від верхівки рогу матки: його середньої і передньої частини. Змінюється з часом і життєздатність ембріонів. У яйцепроводі практично всі вони шага нормальними, проте в міру переміщення їх у матку і збільшення строку пе- 213 —1.. 1...... -   Розді; ребування їх в умова маткового середови­ща (що не повністк відповідає віку усіх ембріонів), зрости кількість дегенерова-них ембріонів. До     середині; Рис. 44. Гумовий катетер для нехірургічного вимивання ембріонів: 1 - гумова трубка, 2 - надувна кулька, 3 - отвори для введення та виведення рідини, 4 - гумова " заглушка", 5 - сталевий стилет, 6, 7 - надувний канал, 8 - розширення каналу, 9 - зовнішній кінець катетера із замковим вузлом (10).

70-х років ембріони у корів видобували головно хірургічнії-.: методом, вимиваючі; їх з яйцепроводу чи рогу матки, залежне від часу вимивання При цьому користу­валися одним з трьох доступів: розрізом верхнього склепіння піхви з використанням спеціального приладу (ефеменатора) або без нього; лапаротомією по білій лінії живота із застосуванням наркозу; лапаротомієк з боковим розрізом в ділянці голодної ямки під місцевою анестезією.

Із запропонованих для хірургічного видобування ембріонів інструментів найпри-датнішим виявився прилад Роуса і Даулінга, основою якого є гумовий катетер з на­дувною кулькою в кінцевій частині, привідним та відвідним каналом.

Згодом запропоновано досконаліші металеві, гнучкі, пластмасові та гумові катетери Найширшого розповсюдження набув двоканальний урологічний катетер Фолея, в про­світ якого перед застосуванням встановлюють гнучкий металевий стилет (рис. 44).

Для вимивання ембріонів користуються розчинами, які подібні за своїм складом до секрету матки (рідина Дюльбекко, середовища Ігла, Паркера, ТМС-199, Хема-10, Протасова, Менезо та ін.). Найбільш розповсюдженим є фосфатно-буферне сере­довище (ФБС) Дюльбекко, до 1 л якого перед застосуванням додають 40 г бичогс альбуміну, 1, 0 г глюкози, 0, 036 г пірувату натрію та 100 тис. ОД пеніциліну (калієва сіль). Осмотичний тиск розчинів повинен бути 300 міліосмоль, рН 7, 2-7, 6.

Хірургічне видобування ембріонів з рогів матки шляхом лапаротомії по білій лінії. Витримують тварину два дні на голодній дієті, вводять їй внутрішньом'язовс для заспокоєння ромпун чи комбелен. Фіксують на операційному столі в спинном} положенні і проводять операцію під загальним наркозом. Підготувавши операційне поле, розрізають черевну стінку по білій лінії довжиною 15-20 см спереду молочно: залози, виводять назовні один ріг матки з яйцепроводом і яєчником і підраховують в ньому кількість жовтих тіл. Фіксують тіло матки в раневому отворі, проколюють стін­ку рога матки біля біфуркації гострим гемостатичним пінцетом і вводять через утво-

214

Трансплантація ембріонів

рений отвір стерильний катетер Фолея з надувною кулькою, нагнітають в неї повітря і приступають до вимивання ембріонів матковим чи матково-трубним методом. В пер­шому випадку проколюють верхівку рога матки тупою голкою з оливою для введення промивної рідини і вводять у просвіт рога порційно 120-140 мл рідини Дюльбекко. Збирають промивну рідину через катетер Фолея в стерильну посудину. Аналогічно чинять з другим рогом матки.

При матково-трубному промиванні (застосовується на 3-5-й день після осіменін-ня) тупу голку з еластичним шлангом вводять в ампульну частину яйцепроводу і про­мивають так же.

Закінчивши промивання, опускають матку на своє місце, перевіряють правиль­ність розміщення її рогів, зрошують черевну порожнину фізіологічним розчином, впорскують у неї 1 млн ОД пеніциліну та стрептоміцину, розчинених в 20 мл новока­їну. Накладають кетгутні шви на очеревину, м'язи разом з підшкірною клітковиною, припудрюють поверхню рани порошком трициліну, накладають шовковий шов на шкіру, обробляють її 10 %-ним розчином йоду і обробляють клейовим аерозолем.

Хірургічне видобування ембріонів з рогу матки через лапаротомію в області голодної ямки (справа чи зліва). Даний метод значно простіший, менш трудомісткий: може проводитися під місцевою анестезією. Премедикація у даному випадку вклю­чає внутрішньом'язове введення ромпуна, епідуральну ін'єкцію новокаїну, паралюм-бальну та інфільтраційну анестезію 20 %-ним розчином новокаїну по лінії розрізу.

Фіксують тварину в станку, готують операційне поле і роблять вертикальний розріз: лкіри, підшкірної клітковини та м'язового шару довжиною 15 см на віддалі 8 см спе­реду лінії колінного суглоба між зовнішнім горбом клубової кістки і заднім краєм ре­бра, на 10 см нижче поперечно-реберних відростків поперекових хребців. Підтягують гемостатичним пінцетом очеревину, розрізають її ножицями, розширюють розріз паль­цями і вводять руку в черевну порожнину. Захоплюють великим та вказівним пальцями один ріг матки, підтягують його у просвіт розрізу, підраховують кількість жовтих тіл та проводять вимивання ембріонів спочатку з одного, а тоді з другого рога матки, як описано вище. Завершують операції так же, як при лапаротомії по білій лінії живота.

Кращих результатів досягають при вимиванні ембріонів з рога матки з боку роз-рву, оскільки до протилежного рога важко добратися.

Після операції залишають тварину під наглядом протягом двох тижнів, після чого:: -:: мають шви.

Хірургічний метод видобування ембріонів через розріз верхнього склепіння ліхви (трансвагінальний метод). Фіксують тварину в станку і підраховують (рек-ииьно) кількість жовтих тіл у кожному яєчнику, наводять туалет перинеальної об-всті, проводять епідуральну анестезію, забинтовують корінь хвоста, відводять його вбік і зрошують внутрішню поверхню піхви 2 %-ним розчином діоциду.

Старанно миють і обробляють руки, беруть скальпель, затискають його між скла­деними конусом пальцями і вводять руку в піхву. Роблять з одного боку шийки матки ИВраоназальний розріз склепіння піхви довжиною 2-3 см. Виймають з піхви скаль-

215

Розділ '

пель, вводять через розр:: в черевну порожнину спо­чатку два пальці, потім ре­шту і тоді цілу руку, спеці­ально підготованою тупок голкою (діаметром 1-2 мм проколюють біля біфуркації іпсілатеральний ріг матки (що з'єднаний з яєчником, в якому виявлені жовті тіла і вводять через утворений отвір кінець катетера з на­дувною кулькою для вими-

Рис. 45. Схема нехірургічного вимивання ембріонів. ---- ^вання ембріонів. Наггата-
-------------------------------------------------------------------  ють в кульку 7-10 см³ пові­
тря і за допомогою шприца
вливають в ріг матки теплу (37 °С) промивну рідину і відсмоктують її назад.

Вимивання ембріонів з геніталій вбитих тварин виявляється ефективним, якшс після забою пройшло не більше 2-2, 5 годин.

Нехірургічне добування ембріонів.

Хірургічні методи добування ембріонів складні та трудомісткі; їх можна застосо­вувати у однієї тварини не більше трьох раз. Тому в практичних умовах звичайно ко­ристуються нехірургічним методом, що базується на введенні в матку приладу через закриту шийку матки. Метод можна застосовувати безпосередньо на фермі, на 7—8-й день після осіменіння. Голодна витримка тварин не обов'язкова.

При цьому користуються металевими гнучкими, пластмасовими, латексними, гу­мовими двоканальними чи триканальними катетерами. Особливе значення тут має техніка " м'якого" проходження інструментом шийки матки.

Робота виконується групою з трьох чоловік: оператор і два помічники. Заводять ко­рову в манеж, фіксують її в станку, звільняють пряму кишку від калових мас, визначають стан статевих органів та кількість жовтих тіл у кожному яєчнику. Правда, яєчники важко пальпуються і точно встановити кількість жовтих тіл, без відповідного досвіду, не легко.

Наводять туалет перинеальної області і роблять епідуральну анестезію, вводячи 5 мл 2 %-го розчину новокаїну, ксилокаїну чи медокаїну або 8-10 мл 2 %-го розчину прокаїну. Для зняття напруження кишки можна ввести внутрішньом'язово 0, 5-0, 7 мл ромпуна чи 0, 7-1, 0 мл комбелену.

Беруть чистий стерильний катетер, вставляють у його простір металевій стилет і вводять його в піхву в напрямку шийки матки. Ліву руку вводять у пряму кишку, про­мацують нею катетер, скеровують його кінець в устя шийки матки, захоплюють її ру­кою і натягують обережно на катетер. Після цього просовують катетер на всю глибин} в іпсілатеральний ріг матки, виймаючи обережно стилет. Помічник нагнітає в кульку

216

~ рансплантація ембріонів

10—15 см³ повітря і, з'єднавши зовнішній кінець катетера з наповненим промивною рідиною 50-мілілітровим шприцом, вводить його вмістиме у порожнину рога мат­ки і відсмоктує назад. Оператор при цьому легко масажує ріг матки і дещо підіймає його верхівку. Зливши обережно промивну рідину по стінці в стерильний циліндр чи мензурку і, накривши її стерильною фольгою, помічник знову набирає свіжу порцію - зчину в шприц і промиває ним ріг матки і т. д.

На один ріг матки витрачають до 500 мл рідини. При цьому слід уникати зворот­ного введення відсмоктаної рідини та попадання в неї крові. Введена кількість ріди­ни повинна відповідати кількості відсмоктаної. Якщо промивна рідина втрачається і проходить мимо кульки, то збільшують в ній тиск повітря, проте при надмірному тиску повітря можуть виникати розриви слизової оболонки.

Закінчивши промивання одного рога матки, випускають з кульки повітря і вводять І:: г суміш антибіотиків, розчинених у 20 мл 0, 5 %-го розчину новокаїну. Після цього беруть інший стерильний катетер, вводять його в такій же послідовності в другий ріг шахи і промивають його.

Збирають промивну рідину в стерильний мірний циліндр чи ділильну лійку і на­вівають фольгою.

Є повідомлення (В. та Л. Мадісон), що від однієї корови вимили 37 ембріонів, з їкігх 26 виявилися придатними для пересаджування та заморожування.

У телиць внаслідок щільного закривання шийки матки після охоти нехірургічне ■ шивання ембріонів буває важким, особливо, коли для вимивання ембріонів засто-. вують товстий французький катетер з телескопічним зондом та системою проточ­не шлангів. В подібних випадках перед введенням катетера попередньо розширюють І: гзікальний канал за допомогою металевого чи скляного дилятатора. Промивна ріди­ні при цьому самопливом поступає у матку і повертається у збірну посудину. Під час ■ ра: ивання матки будь-яким методом потрібно постійно контролювати положення ка­пера, який скороченнями міометрію поступово переміщається з рога в тіло матки.

У наведеній таблиці зроблено порівняння хірургічного і нехірургічного методів намивання ембріонів (за А. Брендом).

До головних невдач, що трапляються при вимиванні ембріонів, можна віднести:

> іноді не вдається пройти катетером цервікальний канал. У подібних випадках
:._." -тосовують сакральну анестезію, теплі зрошення шийки матки, ін'єкції аналогів
ТіТ-Рна, ханегіфу та ін.;

> важко виймається стилет з введеного катетера - необхідно підібрати до нього
нстилет;

> при застосуванні малих катетерів у телиць іноді його наконечник закупорю­
йся слизом, що перешкоджає витіканню промивної рідини;

> при надмірному чи швидкому наповнені кульки повітрям можуть спостеріга-
: і проколи чи розриви ендометрію, внаслідок чого промивна рідина проникає під

]: не витікає;

217

Розділ

> при інтенсивному промиванні рогів матки, стисканні їх руками може також пошкоджуватися слизова оболонка матки і в промивній рідині з'являється кров.

Таблиця 13 Порівняльна оцінка методів вимивання ембріонів

 

Хірургічні методи	Нехірургічні методи
Переваги
Донор нерухомий.	Донор відносно нерухомий.
Забезпечення стерильності.	Можливість пересаджування в умовах
	ферми.
Безпосереднє маніпулювання з маткою.	Не потрібне голодне витримування.
Точна оцінка стану яєчників.	Менші затрати часу.
Потрібна невелика кількість промивної	Немає хірургічного ризику.
рідини.
Недс	ліки
Утворення спайок.	Необхідна висока техніка маніпулювання
	з рогами матки.
Ризиковане застосування загального	Потрібно біля 500 мл промивної рідини
наркозу.	на один ріг.
Складності застосування методу у	Важко забезпечити стерильність.
лактуючих тварин.
Необхідне складне хірургічне	Іноді неможливо пройти цервікальний
обладнання.	канал.
Потрібне голодне витримування тварин.

Вирішуючи питання про кратність використання донорів, виходять з того, що їх реакція на гормональні препарати не завжди буває однаковою. Лише, у незначної час­тини тварин рівень овуляції утримується на одному рівні, у других він поступово знижується, у третіх - має форму ввігнутої кривої, четверті - постійно реагують міні­мальним числом овуляцій і п'яті - взагалі не реагують. Все це слід враховувати.

Окремі автори (Н. П. Кириловаз співавторами) повідомляють, що із збільшенням числа овуляції знижується заплідненість яйцеклітин і зменшується кількість нормаль­них ембріонів. У однієї вибракованої голштинської корови з надоєм за п'яту лактацію 8 713 кг молока автори за 6 вимивань з інтервалом 60 днів отримали 84 ембріони, з яких лише 33 були придатними для пересаджування та заморожування.

Крісті з співробітниками у досліді на 14 донорах за 10 циклів суперовуляції отри­мали в середньому по 10, 2 ембріони за одне вимивання, які розміщувались в порядку проведення дослідів таким чином: 14, 25; 10, 9; 11, 5; 10, 5; 11, 4; 11, 6; 10, 0; 0; 7, 0; 6, 5; 8, 2. Тобто поза всякою закономірністю.

218

Трансплантація ембріонів

7.7. Технологія роботи з ембріонами

Зібрану в скляний циліндр під час вимивання ембріонів промивну рідину накри­вають алюмінієвою фольгою, передають у стерильний бокс, де ставлять на півгоди­ни в термостат для відстоювання. Для уникнення забруднення промивної рідини та ембріонів у багатьох зарубіжних центрах всі маніпуляції з ембріонами проводять під ламінарною течією відфільтрованого повітря у спеціальних шафах, де низхідні течії стерильного повітря перешкоджають проникненню мікрофлори.

Після відстоювання промивної рідни відсмоктують за допомогою сифону її верх­ній шар, а залишених на дні 50-100 мл розливають обережно по 20-30 мл у чашки Петрі, дно яких для зручності розкреслено на квадрати, розміром 1 х 1 см, і досліджу­ють під стереоскопічним мікроскопом (МБС-9) чи бінокулярною лупою при 15-25-кратному збільшенні.

Досліджуючи уважно промивну рідину під мікроскопом, намагаються перш за все " виловити" в ній усі ембріони та незапліднені яйцеклітини і перенести їх у маленьку чашку Петрі для детальної оцінки і дальшої роботи з ними.

Оцінюючи стан кожного ембріона, звертають увагу на: відповідність стадії роз­витку ембріона його віку; форму прозо­рої оболонки та її цілість; рівномірність дроблення бластомерів; стан цитоплазми; прозорість перивітелінового простору.

Біологічно повноцінні ембріони мають гітку кулясту форму, прозору гомогенну цитоплазму, непошкоджену прозору обо­лонку, однакового розміру бластомери з щільним міжклітинним комплексом. Емб-

ни, що містять різних розмірів бласто-ври з нечіткими клітинними мембранами п іншими ознаками дегенерації, вважа-к ться неповноцінними.

Рис. 46. Ранні стадії розвитку ембріона ве-

ії рогатої худоби:

иезапліднсна яйцеклітина та спермій (ПО- прозора: знка, Ж-жовткова оболонка, 1ПТ — перше напрямне

іьце. С - спермій); 2) зигота, 1-й день розвитку (ПВП -ксивітсліновий простір); 3) 2-й день, ембріон на стадії 1- ітастомерів (Б); 4) 2—3-й день, 4-клітинна стадія роз-• —•-. ембріона; 5) 3—4-й день, 8-клітинна стадія; 6) 5-б-й існї. морула; 7) 6-7-й день, рання бластоциста (ПБ - по-т>: ~книна бластоцисти); 8) 7—8-й день, експандована блас--мінста (Е - ембріобласт, Тр - трофобласт); 9) 8-9-й Х'-ь. бластоциста на стадії вилуплення; 10) 9—11-й день, нелуплена бластоциста; 11) 12-й день, пізня бластоциста;

1 - 4-й лень, видовжений бластодермічний міхурець.

219

Розділ

Вище наводились основні риси ембріона на ранніх стадіях його розвитку. Ці риси слід чітко пам'ятати і по них оцінювати " вік" ембріона, його повноцінність. При ви­миванні ембріонів з яйцепроводів практично всі вони бувають на стадії ранньої мору-ли, тоді як при вимиванні ембріонів з рога матки більшість з них буває на стадії ран­ньої бластоцисти. Внаслідок деякої розтягнутості суперовуляції тут можуть зустріча­тися і морули, і пізні бластоцисти, і незапліднені яйцеклітини в стані дегенерації (зі зморщеною, нерівної форми цитоплазмою), і, нарешті, зародки неправильної форми, з порушеннями цілості прозорої оболонки, її розривами, розшаруваннями, стисненою порожниною, нерівномірним дробленням, порушеннями міжклітинних зв'язків, гра­нуляцією протоплазми. Відправною рискою при оцінюванні ембріонів є день цикл). на який проводиться вимивання, і типічні для даного " віку" риси ембріона.

Ембріони, що різко відстали у своєму розвитку, з вираженими ознаками асинхрон-ності дроблення бластомерів, їх дегенерації непридатні для трансплантації, тоді як ембріони з незначними морфологічними змінами вважаються умовно придатними.

Значно більші зміни спостерігаються у збережених у замороженому стані ембріо­нів, тому оцінка їх буває важчою.

Існує декілька підходів до оцінки ембріонів. Греве пропонує оцінювати їх за таки­ми показниками: життєздатні - ембріони, стадія розвитку яких співпадає з їх віком, що відраховується, починаючи з дня осіменіння; сповільнені (ретардовані) - ембріо­ни, які виявляються на дещо ранніх стадіях розвитку, ніж очікувалося в зв'язку з їх віком; вироджені (дегенеровані) - ембріони з різними ознаками дегенерації.

Райт класифікує ембріони за морфологічними ознаками на: нормальні; ембріони з незначними відхиленнями; ембріони із збільшеною кількістю дегенерованих клітин.

М. І. Сергєєв та Ф. І. Осташко запропонували 5-бальну систему оцінки ембріонів за морфологічними ознаками.

Проте на підставі морфологічної оцінки ембріонів важко зробити висновок про їх життєздатність. Все залежить від їх розвитку в процесі культивування і від при­живлення їх в розі матки. На жаль, точніших, а головне - доступних для виробництва методів поки що немає.

В сумнівних випадках можна залишити вимиті ембріони в невеликій кількості по­живного середовища на 30-40 хв. в термостаті для діагностичного культивування.

Короткотермінове збереження та культивування ембріонів. Від видобування ембріонів у донорів до пересаджування їх реципієнту проходить звичайно не менше З годин. Протягом цього часу потрібно зберегти життєздатність ембріонів.

Для цього ембріон можна помістити в 0, 5 мл середовища на годинниковому скель­ці, поставити його в стерильну чашку Петрі, дно якої вистелене вологим фільтруваль­ним папером, накрити і поставити в термостат з температурою 37 °С.

Для більш тривалого зберігання ембріона (у відповідному середовищі в ампулах, поліхлорвінілових пайетах для осіменіння) засмоктують ембріон в пайету таким чи­ном, щоб з обох боків його утворилися повітряні пухирці довжиною 1-1, 5 см. Закри­вають кінці пайети стальними кульками чи поліетиленовими корками і поміщають в

220

Трансплантація ембріонів

термостат при 37 °С чи під шаром стерильного вазелінового масла на годинниковому склі чи у пробірці,

В таких умовах біологічно повноцінні ембріони можуть зберігатися до 24^8 го­дин, але в практичних умовах культивування при 37 °С застосовують лише як виму­шений короткочасний захід.

В кінці культивування обов'язково перевіряють під мікроскопом життєздатність ембріонів.

Одним з прикладів успішного зберігання ембріонів при температурі тіла є досліди кембріджських вчених по пересаджуванню ембріонів овець у яйцепроводи кролиці, які дозволили здійснити ряд міжконтинентальних перевезень ембріонів з послідую-чою їх ретрансплантацією. Після хірургічного пересаджування таких ембріонів отри­мано нормальних нащадків.

Можна також зберігати ембріони при знижених плюсових температурах, що ви­кликають зворотне гальмування метаболічних процесів.

Кріоконсервування ембріонів. Ще в 1953 р. О. Сміт вперше вдалося заморозити ембріони кролика, проте для перенесення цих дослідів на сільськогосподарські тва­рини потрібно було біля 20 років.

Оптимальною стадією для заморожування ембріонів великої рогатої худоби є ран­ня бластоциста, овець і кіз - пізня морула чи рання бластоциста, свиней - бластоцис­та; краще переносять заморожування свіжі ембріони.

Заморожування та розморожування ембріонів може супроводжуватися кристалі­зацією води в бластомерах та концентрацією розчинених речовин у рідкій фазі. Ці два процеси можуть проявлятися одночасно, хоча кристалізація більш виражена при відносно швидкому, а осмотичні зміни - при повільному заморожуванні.

Слід підкреслити, що процес заморожування ембріонів є набагато складнішим від івморожування сперми, оскільки ембріони є багатоклітинними утвореннями. Тому д> же важлива роль відводиться підготовці ембріонів до заморожування, їх захисту від температурних та осмотичних пошкоджень.

В процесі заморожування ембріонів спочатку знижується температура в навколо-клітинному середовищі, тут поступово збільшується кількість льоду, тоді як в решті розчину зростає концентрація солей.

Виникає таким чином різниця осмотичного тиску між позаклітинною та внутріш­ньо-клітинною фазами, яка може бути зрівноважена шляхом віддачі клітинами води в позаклітинне середовище.

Для уникнення кристалізації внутрішньоклітинної води до складу середовища до­лають кріопротектори диметилсульфоксид (ДМСО) чи гліцерин, а щоб не допустити осмотичних зрушень - штучно стимулюють кристалізацію на певній стадії. Проте нме введення до складу середовища з ембріонами кріопротектора, як і його видален­ню, може викликати осмотичні зрушення. Тому, це насичення (еквілібрацію) роблять о: ступово, поміщаючи ембріони на годинникових стеклах в чашках Петрі спочатку В 5-Ю хв. у 0, 25 М розчин ДМСО, тоді - в 0, 5 М, 1, 0 М і нарешті - 1, 5 М розчин.

221

Розділ 7

В останньому розчині ембріони витримують 15-20 хвилин. Якщо кріопротектором служить гліцерин, то спочатку ембріони поміщають на 10 хв. у 3, 3 %-ий його розчин, тоді на 14 хв. у 6, 6 %-ий і в кінці на 30 хв. у 10 %-ий розчин. Після розморожування ембріонів їх також відмивають від кріопротектора, переносячи поступово з розчинів з більшою концентрацією кріопротектора в менш концентровані розчини.

Закінчивши насичення ембріонів кріопротектором їх розфасовують по пробірках, ампулах чи пайетах для заморожування, яке проводять одно- чи двоетапним методом. повільно чи швидко. В пайети ембріони поміщають в такій послідовності: середови­ще - повітря - середовище з ембріоном - повітря - середовище. Кожен стовпчик по­винен займати в пайеті біля 1-2 см довжини. Один край пайети закривають зволоже­ним корком.

Для зниження перепаду температур і уникнення осмотичних змін, за 4-5 °С до початку льодоутворення стимулюють кристалізацію, додаючи до розчину зернин}" льоду, кристалик йодистого срібла чи просто переохолоджений предмет (проколюють фольгу пінцетом з намерзлою на кінці краплею середовища і швидко торкаються ним поверхні рідини).

Повільне заморожування і повільне розморожування ембріонів. Охолоджу­ють ембріони від 20 °С до -7 °С зі швидкістю 1 °С/хв., викликають кристалізацію і тоді охолоджують зі швидкістю 0, 3 °С/хв. до -36 °С далі - зі швидкістю 0, 1 °С/хв. до -60 °С і переносять в рідкий азот.

Розморожують ембріони в спиртовій бані - скляній циліндричній колбі з температу­рою -50 °С, куди поміщають пробірки чи ампули з ембріонами і розморожують зі швид­кістю 4 °С/хв. до 10 °С, після чого переносять на 5 хв. у водяну баню з температурою 20 °С. Нарешті, переносять ембріони в середовище для видалення кріопротектора.

Швидке заморожування та розморожування ембріонів. Охолоджують ембрі­они у міні-пайетах - від 20 °С до 7 °С зі швидкістю 1 °С/хв., викликають кристаліза­цію і тоді охолоджують зі швидкістю 0, 3 °С/хв. лише до -30 °С і переносять в рідкий азот. Розморожують ембріони у водяній бані з температурою 37 °С протягом ЗО сек. зі швидкістю 3, 0 °С/хв.

НДІ тваринництва Лісостепу і Полісся УРСР запропонував свою технологію за­морожування ембріонів: свіжовимиті ембріони переносять на 10 хв. в 0, 5 М розчин ДМСО на середовищі ФБС, тоді на 20 хв. в таке ж середовище з 1, 3 М ДМСО, після чого, по 3—4 зародки переносять в уленгутівську пробірку з 0, 5 мл 1, 0 М ДМСО на ФБС, герметизують пробірку і поміщають у програмний апарат для охолодження і заморожування.

Заморожування ведуть за такою програмою: від 22-25 °С до 6 °С зі швидкістю 1 °С/хв., штучно збуджують кристалізацію середовища і заморожують від -7 °С до -40 °С зі швидкістю 0, 3 °С/хв., від -40 °С до -60 ° С - зі швидкістю 0, 1 °С/хв., після чого переносять пробірки з охолодженими до -60 °С ембріонами в рідкий азот.

Останнім часом запропоновані технології заморожування ембріонів у соломин­ках, які містять одночасно два середовища - для заморожування (рідина Дюльбекко з

222

' зансплантація ембріонів

[О %-им гліцерином і поміщеним в ній ембріоном) і середовище для розморожування рідина Дюльбекко з 20 % фетальної сироватки і 0, 5 М розчином сахарози). Після розморожування соломинку струшують (для змішування середовищ), витримають на 10-20 хв. при кімнатній температурі і пересаджують ембріон реципієнту.

При заморожуванні ембріонів необхідно суворо дотримуватися технології. За­морожування ембріонів дозволяє значно вдосконалити організацію трансплантації і зідпадає потреба утримання великої кількості реципієнтів і термінового пересаджу­вання вимитих ембріонів. Замість цього можна створювати банки ембріонів, прово­дити трансплантацію розморожених ембріонів реципієнтам після спонтанної охоти, проводити їх експорт та імпорт.

Пересаджування ембріонів

До середини 70-х років пересаджування ембріонів робили в основному хірургіч-■ мш методами, тоді поступово стали запроваджувати нехірургічні методи. Як перші, пж і другі мають свої позитивні та негативні властивості.

Хірургічний метод вимагає хірургічних навичок, спеціального приміщення, від­повідного обладнання та інструментів; він дозволяє вводити ембріони глибоко в ріг віки, що не вдається при нехірургічному пересаджуванні. До того ж в останньому шадку необхідно пройти спеціальним інструментом крізь родові шляхи геть аж до _ вредини рога матки. Шийка матки в цей період буває закритою, а її слизова оболонка: гко травмується; в геніталії може заноситися мікрофлора. Для полегшення введення інструментів іноді застосовують препарати, що заспо-•: : -? ють тварин та розслабляють шийку матки.

Ефективність пересаджування ембріонів залежить перш за все від синхронності юти у донорів і реципієнтів, оскільки стан ендометрію повинен відповідати " віко-^: ■ ■:?.: '" змінам ембріона.

Хірургічне пересаджування ембріонів. Хірургічний метод пересаджування

^г? юнів належить до порожнинних операцій, тому проводити його необхідно в

краційній, обладнаній універсальним фіксаційним станком чи операційним сто-

Лапаротомію проводять по білій лінії черева під загальним наркозом при спин-

13 положенні тварини або в області голодної ямки під місцевою анестезією на

поячій тварині.

Для пересаджування ембріонів можна користуватися модифікованою пастерів-і ис ю піпеткою з лійкоподібним розширенням на кінці капіляру та герметичною зою насадкою на протилежному кінці, приладом Кассу для штучного осіме-: -: ня. за допомогою пайет, російських або французьких звичайних чи телескопіч­них катетерів.

Застосовувані інструменти повинні бути чистими і стерильними. Заправляють пайети ембріонами так же, як для заморожування, тобто спочатку: рають стовпчик середовища Дюльбекко довжиною 1, 5-2 см, тоді такий же стовп-

223

Розділ

чик повітря, далі засмоктують ембріон разом з середовищем, знову стовпчик повітря і нарешті стовпчик середовища.

Одягають на піпетку стерильний поліетиленовий чохол чи накривають її стериль­ною серветкою і зберігають в боксі в горизонтальному положенні до пересаджування

Підготовка тварини до операції і оперативні доступи до матки такі ж, як при ви­миванні ембріонів. При лапаротомії по білій лінії живота знаходять в черевній порож­нині яєчник з активним жовтим тілом; виводять за маткову зв'язку іпсілатеральний ріг матки назовні (в момент розслаблення) і тупою голкою (діаметром 1—1, 5 мм) чи мо­лочним катетером проколюють ріг матки приблизно в 5 см від матково-трубного з'єд­нання. Вводять в утворений отвір капіляр-піпетки з ембріоном в напрямку верхівки рога матки ближче до його матково-трубного з'єднання і зіштовхують вміст піпетки у просвіт рога матки, на його слизову оболонку. Таким же чином переносять другий ембріон в другий ріг матки. При цьому не можна торкатися стінок рога матки.

Щоб переконатися, що ембріони пересаджено в матку, перевіряють використані піпетки під мікроскопом.

Закінчивши пересаджування, перевіряють, чи зайняла матка вихідне положення і вводять у черевну порожнину 250 мл фізрозчину з антибіотиками (по 500 тис. ОД пеніциліну та стрептоміцину в 50 мл новокаїну). Накладають триповерховий шов і залишають реципієнта під наглядом протягом двох тижнів.

Пересаджування ембріонів через розріз черевної стінки в області правої чи лівої голодної ямки значно простіше і менш трудомістке. Готують реципієнта до операції і здійснюють операційний доступ так же, як при вимиванні ембріонів цим методом.

Відкривши доступ до внутрішніх органів, вводять через розріз руку в черевну порожнину, захоплюють великим та вказівним пальцями маткову зв'язку протилеж­ного рога матки, виводять його назовні, пересаджують в його просвіт ембріон (як в попередньому випадку), тоді аплікують ембріон в другий ріг матки. Опускають матку на місце, вводять в черевну порожнину антибіотики, накладають тришаровий шов та клейову пов'язку. Тварина залишається під наглядом протягом двох тижнів, після чого знімають шви.

Ефективність хірургічного пересаджування ембріонів висока, біля 60 %, тому не випадково в багатьох зарубіжних центрах користуються переважно цим методом з лапаротомією в області голодної ямки.

Правда нанесення тварині травми внаслідок резекції м'язів, неможливість багато­разового використання тварини, складності самої операції стримують широке засто­сування цього методу.

Нехірургічне пересаджування ембріонів. Перші досліди по нехірургічному пере­саджуванню ембріонів проведено на початку 60-х років. Застосовувані сьогодні ін­струменти складаються в основному з металевого катетера та довгої капілярної труб­ки, в передній частині якої є приставка для поміщення ембріона в невеликій кількості середовища.

224

Трансплантація ембріонів

Якщо пересаджування здійсню­ють за допомогою гнучкого приладу Касу, то ембріон необхідно помістити в пайету (як вказано вище), вставити пайету в наконечник приладу, з'єд­нати його з основною трубкою. При використанні приладу ВІТ ембріон в _{? ис 47>} пересаджування ембріонів.

такій же послідовності поміщають в ------------------------------------------------------

кінцеву пластикову частину катетера.

Підготовку тварини до нехірургічного пересаджування ембріонів проводять так же, як до нехірургічного вимивання ембріонів - фіксують у станку, наводять туа­лет перинеальної області, роблять сакральну анестезію 2 %-им розчином новокаїну, (5 мл), сильнозбудливим тваринам вводять також міорелаксант комбелен (0, 5 мл).

Беруть у праву руку відповідним чином підготований і заправлений ембріоном катетер і вводять його по верхньому склепінню піхви до шийки матки. Накривають зовнішню частину приладу серветкою (або ж одягають на інструмент гінекологіч­ну рукавицю) і вводять ліву руку в пряму кишку. Промацують матку, визначають в якому яєчнику є жовте тіло і скеровують наконечник катетера в цервікальний канал. Переконавшись, що катетер введено в шийку матки, обережно натягують її на катетер і проштовхують його в іпсілатеральний ріг матки. Обережними рухами просувають і ітетер як можна ближче до верхівки рога матки, постійно контролюючи ректально:; це знаходження голівки катетера.

Пересвідчившись у вірності введення інструмента, подають команду помічнику шести вмістиме катетера в матку. Після цього обережними рухами виймають катетер; передають його на обробку.

Аналогічним чином можна ввести інший катетер в другий ріг матки і зробити так і ане білатеральне (двостороннє) пересаджування ембріонів, хоча приживлення їх в нтрлатеральному розі буває дещо нижчим. М. І. Сергєєв отримував при таких пере-: :: ~жуваннях 55-60 % народжень двійнятами.

На перший погляд пересаджування ембріонів дещо нагадує цервікальне осіменін-: -: = корів з ректальною фіксацією шийки матки. Фактично ж вона значно складніша. їкгцо під час осіменіння шийка матки буває відкритою, а цервікальний слиз воло­ве високими бактерицидними властивостями, то під час пересаджування ембріонів ізшка матки буває закритою, порожнина матки - стерильна, слизові оболонки гені-плій легко травмуються, бактерицидні властивості маткового секрету знижені. Все не необхідно враховувати при роботі, звертаючи особливу увагу на асептику та анти-.: итику і, безумовно, на майстерність роботи.

Слід також пам'ятати, що резистентність геніталій в лютеїнову фазу буває зниже--; к>. а чутливість ендометрію до інфекції - підвищеною, тому бактеріальна інфекція, езз може проникнути в матку при пересаджуванні зародків, є другою за своєю важли-ї: гтю причиною низької результативності трансплантації ембріонів.

225

Розділ

Третім моментом частих невдач є травмування ендометрію інструментами. Кро­вовиливи, що при цьому виникають, негативно впливають на виживання ембріонів. оскільки непрогріта кров є ембріонотоксичною.

Не рекомендується протягом двох місяців після пересаджування вакцинувати, пе­регруповувати чи піддавати іншим стресовим впливам реципієнтів. Через 60-73 днів після пересаджування ембріонів реципієнтів досліджують на вагітність.

Трансплантація ембріонів у інших видів тварин.

Розроблені методи трансплантації ембріонів і для інших видів тварин, правда поки що вони мають більш наукове, ніж прикладне значення.

У овець добування та пересаджування ембріонів проводять лише хірургічним ме­тодом, під загальним чи місцевим наркозом. Р. Аверіл з співробітниками в 1957 р вперше застосували метод інкубації зигот вівці в організмі кролиці. Вони пересадили семи кролицям 18 овечих ембріонів на стадії 2-х-12-ти бластомерів. Через 4-5 днів кролиць забили і з порожнини матки вимили 9 морул та бластоцист. Дві бластоцисті: пересадили вівцематці, у якої овуляція мала місце 6 днів раніше. Через 16 днів її за­били і виявили в рогах матки два нормально розвинені ембріони.

6 квітня 1961 року в англійській газеті " Дейлі експрес" повідомлялося про ори­гінальний дослід, проведений С. Адамсом та Л. Роусоном. Автори пересадили овечі ембріони в яйцепроводи кролиці, яку опісля перевезли в Наталь на віддаль 6 000 миль і отримали після пересаджування приплід (до цього, в 1954 р. М. Ченг та В. Мар-ден перевозили авіапоштою в посудині Дьюара в сироватці крові ембріони кролика із США в Кембрідж і отримали після трансплантації двох кроленят). В 1965 р. в АЙ Казахстану під керівництвом академіка Ф. М. Мухамедгалієва проведено широкопла-нові дослідження по трансплантації ембріонів овець.

В досліді по трансплантації ембріонів, отриманих внаслідок суперовуляції, із яй­цепроводів однієї вівцематки вдалося видобути до 14-ти ембріонів на стадії 2-х-8-ми бластомерів. Восени 1975 р. внаслідок трансплантації таких ембріонів від вівцематки № 1757/9891 породи Лінкольн отримано 9 ягнят- в т. ч. 5 баранчиків. Вирощені ба-рани-трансплантанти в 1976-1979 рр. були використані для осіменіння овець. В ре­зультаті отримано 6 850 ягнят, в тому числі отара ярок (3 000). Таким чином, від овець породи Лінкольн, які важко акліматизувалися в умовах Казахстану, отримало велику кількість баранів-плідників і створено стадо кросбредних овець.

Що ж стосується гормонального викликання багатоплідної вагітності у овець, то воно не доцільне, оскільки при цьому зростає смертність приплоду.

Першу трансплантацію ембріонів у свиней здійсняв О. В. Квасницький, переса­дивши 9 ембріонів, добутих з яйцепроводів миргородської свині, свиноматці великої білої породи і отримав 4-х поросят-трансплантатів. В 60-70-х роках вдосконалено методику ембріопересаджувань, проведено досліди по міжконтинентальному пере­везенню ембріонів свиней з Канади у Великобританію (Вратали та ін.) та із США в Іспанію (Джеймс і Рісер) і Великобританію (Джеймс з співробітниками).

226

Трансплантація ембріонів

Вимивання та пересаджування ембріонів проводять хірургічним методом через 1-3 дня після осіменіння, головним чином з метою підвищення ефективності вико­ристання генетичного потенціалу елітних свиней, інтродукції нових тварин в замкну­тих стадах, отримання нащадків від неплідних елітних свиноматок та в карантинних стадах. Оптимальним вважається перенесення 12-18-ти ембріонів одному реципієн­ту. Свиноматки не здатні виношувати більше плодів, ніж відбулося овуляцій. При пе­ресаджуванні менше 4-х ембріонів вагітність не зберігається.

Складність трансплантації ембріонів у кобил полягає в тому, що у них важко ви­кликати суперовуляцію за допомогою екзогенних гонадотропінів. Тому збільшення кількості приплоду від цінних кобил за допомогою трансплантації можна досягну­ти шляхом багаторазового отримання поодиноких ембріонів нехірургічним методом. Розповсюдження методу в конярстві обмежується також асоціацією з реєстрації по­родних коней, яка довший час не визнавала нащадків, отриманих шляхом штучного осіменіння чи трансплантації ембріонів.

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться: