РАДИОИММУННЫЙ МЕТОД (РИМ) ⇐ ПредыдущаяСтр 5 из 7Следующая ⇒ Сущность метода: метод позволяет в любом биологическом субстрате (моче, крови и т.д.) определять ничтожно малые концентрации растворимых антигенов, продукты метаболизма микроорганизмов, гормоны и пр. на основе конкуренции с радиоактивным антигеном. Этапы постановки реакции 1. Стандартное количество антигена, идентичного меченому радиоактивной меткой (например, I123, I131, либо другими изотопами) антигену, наливают в пробирку. 2. Добавляют стандартное количество иммунной сыворотки, специфичной антигену. 70- 80% меченного антигена связывается при этом с антителами, образуя радиоактивный преципитат. 3. Добавляют субстрат, исследуемый на присутствие предполагаемого антигена. Если в субстрате есть антиген, идентичный меченному, то он конкурирует с ним, отнимая антитела. Радиоактивность преципитат при этом снижается. Чем больше в субстрате антигена, тем меньше радиоактивность преципитата. Приложение 12 Схема постановки основного опыта РСК Ингредиенты Опыт Контроль сыворотки Контроль антигена на антикомпле-ментарность Контроль антигена на гемотоксичность Диагностическая система
Сыворотка крови больного, инактивированная при +56 C° 30 мин., мл	0,5	0,5	-	-
Антиген в рабочей дозе, мл	0,5	-	0,5	0,5
Комплемент в рабочей дозе, мл	0,5	0,5	0,5	-
Физ. раствор 0,85 %	-	0,5	0,5	1,0
Инкубировать в термостате при 37 C° 60 мин.
Индикаторная система (гемолитическая)
Гемолитическая сыворотка в рабочей дозе, мл	0,5	0,5	0,5	0,5
Эритроциты барана 3 % взвесь, мл	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубировать в термостате при 37С° 60 мин.
Соединить I и II системы                                 Выдержать при +37С° 60 мин.
Результаты РСК (пример)	+ + + +	-	-	-
Результат гемолиза	-	+	+	-

 

Оценку РСК проводят по четырехплюсовой системе:

+ + + + Полная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная; резко положительная РСК.

+ + + Неполная задержка гемолиза, эритроциты в осадке, надосадочная жидкость прозрачная, слабо розового цвета; положительная РСК.

+ +   Частичная задержка гемолиза, осадок эритроцитов незначительный, надосадочная жидкость красно-розового цвета, прозрачная; слабо положительная РСК.

+      Осадок незначительный, жидкость красная; сомнительная РСК.

-       Полный гемолиз, прозрачная красная жидкость. Отрицательная РСК.

 

Приложение 13

      СХЕМА ТИТРОВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (В ПРИСУТСТВИИ АНТИГЕНА)

Ингредиенты	Пробирки						Контроли антигена
	1	2	3	4	5	6	Гемотокс.	Антикомпл
Комплемент 1:10	0,05	0,1	0,12	0,15	0,18	0,25	-	0,25
Физ.раствор, мл	0,45	0,4	0,38	0,35	0,32	0,25	0,5	0,25
Антиген, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Инкубировать в термостате при 37С° 40 мин.
Гемолитическая система, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубировать в термостате при 37С°  40 мин.
Учет результатов	Задержка гемолиза		Гемолиз				Задержка гемолиза	Гемолиз

 

Титр комплемента 0,12 (минимальное количество, дающее гемолиз в гемосистеме).

Рабочая доза 0,15 (чуть больше титра, для гарантии).

Приложение 14

СХЕМА ТИТРОВАНИЯ АНТИГЕНА НА АНТИКОМПЛЕМЕНТАРНОЕ

 ДЕЙСТВИЕ

Ингредиенты	Пробирки							Контроль антигена на гемотоксичность
	1	2	3	4	5	6	7
Антиген, мл	0,05	0,1	0,15	0,18	0,20	0,23	0,25	0,25
Физ.раствор 0,85 %, мл	0,45	0,4	0,35	0,32	0,30	0,27	0,25	0,5
Комплемент 1: 10, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	-
Инкубировать в термостате при 37С°  40 мин.
Гемолитическая система, мл	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
Инкубировать в термостате при 37С°  40 мин.
Учёт результатов	Гемолиз			Задержка гемолиза				Задержка гемолиза

 

Титр антигена — то минимальное количество АГ, которое не мешает гемолизу. Это 0,18 мл. Рабочая доза должна быть в 2 раза меньше, это – 0,09 мл.

 

 

Приложение 15

СХЕМА ТЕТРИРОВАНИЯ ГЕМОЛИТИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ

Ингредиенты	Пробирки
	1	2	3	4	5	6	7
Физ. раствор 0,85 %, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Гемолитическая сыворотка 1:50, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	В дез.р.
Разведение сыворотки	1:100	1:200	1:400	1:800	1:1600	1:3200	1:6400
Эритроциты барана 3 % взвесь, мл	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Инкубировать в термостате при 37С°  40 мин.
С׀ 1:10 в раб. титре	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25	0,25
Инкубировать в термостате при 37С°  40 мин.
Учёт результатов	Гемолиз					Задержка гемолиза

 

Титр гемолитической сыворотки — то максимальное разведение, которое даёт гемолиз. Это 1: 1600. Рабочий титр должен быть концентрированнее титра в 3-4 раза, т.е. рабочий титр - 1: 400.

Приложение  16

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: