Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


Аналогично изучается модулирующее повреждающее действие других исследуемых токсикантов.



 

4.3.2 Методика определения чувствительности клеток Paramecium caudatum к повреждающим агентам на фоне действия исследуемых веществ

 

Алгоритм исследования:

1. Выявление протективных свойств (качественная характеристика) у веществ различной природы.

Для этого на предметные стекла наносятся по шесть капель (50 мкл) культуры парамеций (в поле зрения не менее 5 особей), одна капля служит контролем, ко всем остальным добавляют тангенциально (сбоку) каплю соответствующего объёма (50 мкл) исследуемого вещества пороговой концентрации (Пк), время экспозиции 10 минут. Выдержав указанное время, ко всем каплям добавляют соответствующий объём (50 мкл) повреждающего агента следующим образом: на 1-ое стекло - пороговую концентрацию (Пк), на 2-ое стекло – остановочную концентрацию (Ок), на 3-е стекло – лизирующую концентрацию (Лк). При добавлении токсикантов фиксируются функциональные и структурные изменения в сравнении с контролем.

На основании способности исследуемого вещества повышать толерантность парамеций к действию токсикантов, делают вывод о наличии у исследуемого вещества протективных свойств – специфической биологической активности (например, антиоксидантной и мембраностабилизирующей). Увеличение толерантности проявляется способностью клеток парамеций соответственно не изменять своих функциональных и структурных характеристик при добавлении пороговых, остановочных и лизирующих концентраций токсикантов в сравнении с контролем.

Например: таким образом, антиоксиданты сохраняют структуру клеточных мембран от действия ПОЛ, обеспечивая её структурную и функциональную стабилизацию.

2. Определение протективных свойств (количественная характеристика) у веществ различной природы.

Затем устанавливаются те концентрации токсикантов, которые замедляют (ускоряют), останавливают движение и лизируют клетки Paramecium caudatum в присутствии исследуемых веществ. По данным эксперимента строятся графики и диаграммы.

Разница между действующими концентрациями повреждающих агентов на фоне предварительного введения исследуемого вещества и концентрациями в контроле составляет величину, которая количественно характеризует протективную активность исследуемого вещества и выражается степенью защиты – числовым значением разницы между концентрацией токсикантов в контроле и на фоне предварительно введенного исследуемого вещества.

Определение протективных свойств антитоксических сывороток

На биомодели Paramecium caudatum выявляется и определяется защитная способность специфических антитоксических сывороток по данному алгоритму исследования.

В этом случае в роли повреждающего агента выступают исследуемые токсины различной природы, а в роли защитных веществ (протекторов) антитоксические сыворотки к ним.

 

4.3.3. Хронологический контроль протективного действия исследуемых веществ

Остановочные концентрации повреждающих агентов вызывают у Paramecium caudatum токсический эффект – обездвиживание – не сразу, а в течение некоторого времени (см. таблицу 2). Вещества-протекторы повышают остановочную концентрацию токсикантов для Paramecium caudatum, но и в их присутствии токсический эффект развивается во временном интервале. Этот хронологический интервал может служить количественной характеристикой защитного действия протектора.

Например:

Временной интервал, в течение которого растительные экстракты продлевают способность парамеций защищаться от действия клеточных ядов – этанола в 14% концентрации и пероксида водорода - 1×10-4 г/мл в сравнение с интактными, положен в основу ранжирования протективных свойств веществ-адаптогенов.

Таким образом, в качестве информативных показателей биологической (протективной) активности веществ различной природы предлагаются:

- пороговая концентрация исследуемого вещества;

- степень защиты;

- нижний предел остановочной концентрации токсиканта;

время жизни Paramecium caudatum в растворах-ядах.

 

4.4. Методики изучение биологической активности и токсичности исследуемых веществ в хроническом опыте на Paramecium caudatum

4.4.1. Определение влияния исследуемых объектов на аппарат размножения и темп роста Paramecium caudatum

В хроническом опыте определяют, прежде всего, влияние исследуемых веществ на генетический аппарат (геном) клетки Paramecium caudatum.

Этот тест является информативным для выявления эстрогенной активности (по темпу размножения) и стимулирующей активности на белковый обмен (по темпу роста).

Изучение токсичности в хроническом опыте проводится при культивировании Paramecium caudatum в течение нескольких дней в растворах исследуемых веществ пороговой концентрации. Исследования удобнее проводить в планшетах для иммунобиологических исследований, можно и на предметных стёклах с лункой, помещёнными во влажную камеру. Для исследований в каждую лунку вносят по 50 мкл исследуемого вещества, к которым затем помещают по 50 мкл культуры парамеций с количество особей в одной капле (50 мкл) – 5-10. Контролем служат интактные клетки культуры Paramecium caudatum, разведенной в среде Л-Л как в опыте. Растворы инкубируются при температуре – 20-26°С.

При делении Paramecium caudatum образуются крупные одинаковые клетки (90-140 мкм). Темп размножения делением составляет 2-3 генерации в сутки. Время тестирования – 3-7 суток. В процессе наблюдения за культурой клеток фиксируется число особей в одной капле и средний (преобладающий) размер клеток. Для подсчёта числа инфузорий используется гемоцитометрический способ (камера Горяева). Различие в концентрации живых парамеций в опытной и контрольных пробах, а также в их размере является критерием токсичности или экологического благополучия среды для одноклеточного организма (табл. 5).

Вещества, в экологическом отношении благоприятные для Paramecium caudatum, стимулируют в сравнении с контролем темп размножения и роста, так максимальный размер при достаточном бактериальном питании достигает 280 мкм, а характер и темп движения остаются неизменными.

 

Таблица 3

Результаты определения влияния исследуемых веществ на аппарат размножения и темп роста Paramecium caudatum (хронический опыт)

Объект исследования Исходное количество парамеций в 50 мкл Количество парамеций спустя 3 суток Размер парамеций и форма (мкм) Характер движения
Контроль 5-10 30-40 90-100 удлинённые активны
Исследуемый объект 5-10      

 

4.4.2 Фармако- и токсикокинетические исследования

Нарастание токсического эффекта наблюдается как с увеличением концентрации токсикантов, так и во временном режиме, то есть по времени проявления токсического эффекта (остановка клеток Paramecium caudatum).

Защитный эффект зависит от природы протектора и также развивается во временном пространстве.

Продолжительность периода зрелости биомодели Paramecium caudatum исчисляется сотнями и тысячами клеточных делений, что позволяет разрабатывать условия хронического эксперимента, с оценкой жизнеспособности клеток

Совокупность всех этих факторов позволяет проводить сравнительные исследования веществ различной природы [2,9].

 

А. Индивидуальные

Время предварительного контакта исследуемого объекта с клетками Paramecium caudatum (время экспозиции) зависит от характера биологической (фармакологической) активности. Например, экспериментально установлено, что для антиоксидантов прямого действия (например – витамин Е) целесообразно проводить острый опыт (10 минут), для антиоксидантов непрямого действия (например – селенит натрия) хронический опыт (время экспозиции - 24 часа).

При анализе фармакокинетических кривых, определяется максимальный защитный эффект от действия токсикантов на Paramecium caudatum, который развивается во времени, при дальнейшем увеличении времени экспозиции – наблюдается постоянство эффекта (плато) и затем эффект снижается.

 

Б. Сравнительные

В пролонгированных исследованиях изучение изменения толерантности парамеций к клеточным ядам проводится в течение нескольких недель при культивировании Paramecium caudatum в растворах исследуемых веществ пороговой или иной установленной концентрации в любых удобных сосудах. Для этого смешивают равные объемы исследуемого вещества и культуры парамеций с количество особей в одной капле (50 мкл) – 5-10, в начале стационарной фазы роста.

С целью выяснения развития защитного эффекта во времени –устанавливаются для исследуемых веществ концентрации токсикантов (по общей методике, п. 4.1) замедляющих (ускоряющих), останавливающих движение и лизирующих клетки парамеций. Для этого на исследование берут по капле (50 мкл) взвеси, к которой тангенциально добавляют по капле (50 мкл) токсикантов, начиная с 24 часов от начала эксперимента в течении двух недель через определённые интервалы времени.

Данные обрабатываются статистически с использованием коэффициента Стьюдента. По данным эксперимента строятся диаграммы и графики.

 


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2019-04-20; Просмотров: 275; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.023 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь