Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


ТИПИЧНЫЕ РЕАКЦИОННЫЕ СМЕСИ ДЛЯ ПЦР



Анализируемая ДНК. Это может быть как отдельный кусочек молекулы, так и плазмида, хромосома или геном клетки полностью. Для грубой оценки сойдет даже суспензия клеток. ДНК служит матрицей для многократного копирования нужного участка.

Праймеры.Праймер — это искусственно синтезированная короткая цепочка нуклеотидов (15–30 штук), комплементарная выбранному участку одной из цепей анализируемой ДНК. Один из праймеров обычно соответствует началу амплифицируемого отрезка, другой — его концу, но на противоположной цепи. У праймеров, как и у любого олиго- или полинуклеотида, есть 3ˊ - и 5ˊ -концы.

                                           9

Нуклеотиды. А точнее, дезоксинуклеотидтрифосфаты — четыре вида «кирпичиков» для строительства цепей ДНК: дАТФ, дТТФ, дЦТФ и дГТФ.

ДНК-полимераза. Фермент, строящий комплементарную матричной цепь ДНК. Он может начинать синтез только от 3ˊ -конца праймера. Обычно используют термостабильные полимеразы, изначально выделенные из термофильных бактерий и архей: Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза) и Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза). Первая — самая производительная, а две другие — более точные.

Буфер. Раствор, содержащий различные ионы для поддержания нужного рН, соли магния, необходимые для работы полимеразы, и неионный детергент Tween-20 в сочетании с BSA (бычьим сывороточным альбумином) для предотвращения налипания компонентов реакции на стенки пробирки. В случае ГЦ-богатых матриц в смесь часто добавляют энхансер — ДМСО (диметилсульфоксид), предотвращающий нежелательные взаимодействия между комплементарными участками матрицы.

 

 

            1.6.ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЯВЛЯЕМЫЕ ПРИ ПЦР

 

Анализ на инфекции ПЦР позволяет диагностировать множество инфекций, причем по результатам анализа ПЦР можно определить и степень распространения инфекции, что очень важно для правильного назначения лечения. Анализ ПЦР назначается для определения возбудителей следующих заболеваний:

1) гепатит В и С, выявляется путем обнаружения в биологическом материале ДНК соответствующего вируса;

2) хламидиоз, выявляется путем обнаружения ДНК Chlamydia trachomatis;

3) уреаплазмоз, выявляется путем обнаружения ДНК Ureaplasma urealiticum и Ureaplasma parvum;

4) микоплазмоз, выявляется путем обнаружения ДНК Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium;

5) кандидоз, выявляется путем обнаружения ДНК Candida albicans;                                                       6) бактериальный вагиноз, выявляется путем обнаружения ДНК Gardnerella vaginalis;

7) трихомониаз, выявляется путем обнаружения ДНК Trichomonas vaginalis;

8) инфекционный мононуклеоз, выявляется путем обнаружения ДНК вируса Эпшетейна-Барра;

9) туберкулез, выявляется путем обнаружения ДНК микобактерии туберкулеза;

      

                                          10

10)  папилломавирусная инфекция, выявляется путем обнаружения ДНК вируса папилломы человека;

11) ВИЧ (СПИД), выявляется путем обнаружения ДНК вируса иммунодефицита человека;

12) герпесная инфекция, выявляется путем обнаружения ДНК вирусов простого герпеса 1 и 2 типов;

13) хеликобактериоз, выявляется путем обнаружения ДНК Helicobacter pylori. 

 

                                         

    1.7.БИОЛОГИЧЕСКИЙ МАТЕРИАЛ, ВЗЯТЫЙ НА ПЦР

Для ПЦР диагностики применяются различные биологические среды и жидкости, взятые из организма человека: мокрота, слизь, слюна, моча, кровь, соскоб эпителиальных клеток, ткани плаценты, плевральная жидкость, околоплодная жидкость, сок простаты и др.

 

При диагностике ЗППП (ИППП) анализу подвергаются выделения из мужских и женских половых органов. Для этого выполняют мазок или соскоб из уретры или шейки матки. Также для исследования используют мочу.

 

Для выявления инфекций (герпес, мононуклеоз, ЦМВИ, токсоплазмоз, ВИЧ, гепатиты В и С) на анализ берут кровь. При подозрениях на поражения нервной системы производят забор спинномозговой жидкости.

 

Для пульмонологических исследований используют плевральную жидкость и мокроту.

 

 Для выявления внутриутробных инфекций анализу подвергают ткани плаценты и околоплодную жидкость.

 

Кровь

 

Забор крови производится натощак из локтевой вены одноразовой иглой (диаметр 0, 8-1, 1 мм) в одноразовый шприц объемом 5 мл или специальную вакуумную систему типа “Venoject” (с ЭДТА). При заборе в шприц кровь из него аккуратно (без образования пены) переносится в одноразовую пробирку с антикоагулянтом (6% раствор ЭДТА в соотношении 1: 19 или 3, 8% раствор цитрата Na в соотношении 1: 9. Гепарин в качестве антикоагулянта использовать нельзя), пробирка закрывается пробкой и переворачивается несколько раз (для перемешивания с антикоагулянтом). Пробирка с кровью до исследования хранят в холодильнике при +4°С – +8°С.

                                          11

Максимальный срок хранения:

При исследовании на вирусные гепатиты – 2 суток

 

При исследовании на другие инфекции – 5 часов

 

                                         

Моча

 

Для анализа отбирается первая порция утренней мочи в количестве 10 мл в специальный флакон или пробирку без консервирующего раствора.

 

     Максимальный срок хранения отобранного материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С.

 

Слюна

 

Перед забором слюна производится трехкратное полоскание полости рта физиологическим раствором. Забор слюны производится в одноразовые пробирки в количестве 3-5 мл.

 

Материал необходимо отбирать непосредственно перед исследованием или немедленно доставлять в лабораторию. При невозможности быстрой доставки материал замораживают при –20 °С. Последующая транспортировка осуществляется в замороженном состоянии (в термосе со льдом).

 

Мазок из ротоглотки

 

Забор материала производится рабочей частью стерильного одноразового аппликатора с задней стенки глотки и крипт миндалин. После забора материала аппикатор помещают в стерильную одноразовую пробирку.

 

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

Мокрота и плевральный выпот

 

Материал отбирают в специальные флаконы в количестве 5-10 мл.

 

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

Биопсийный материал

                                           12

Биопсийный материал помещают сухую одноразовую пробирку типа “Эппендорф”.

 

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

 

                                         

Синовиальная жидкость

 

Забор материала производится одноразовым шприцом в количестве 1 мл. Отобранный материал помещают в сухую одноразовую пробирку типа “Эппендорф”.

 

                                             

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

Забор материала для анализа на урогенитальные инфекции.

 

Забор материала у женщин:

 

Соскоб производится из трех различных точек:

 

цервикальный канал

 

задний свод влагалища

 

уретра

 

При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II, Haemophilus ducrei).

 

Забор производится универсальным зондом или ложкой Фолькмана. Если соскоб взят универсальным зондом, рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа “Эппендорф” с консервирующим раствором. Если забор производится ложкой Фолькмана, рабочая часть инструмента споласкивается в консервирующем растворе, содержащемся в одноразовой пробирке типа “Эппендорф”.

 

 

                                          13

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

Забор материала у мужчин:

 

Соскоб (мазок).

 

Забор материала производится универсальным зондом из уретры. При необходимости материал для исследования берется из генитальных язв (исследование на HSV-II, Haemophilus ducrei).

 

                                             

Рабочая часть зонда, содержащая исследуемый материал, отрезается или обламывается и помещается в одноразовую пробирку типа “Эппендорф” с консервирующим раствором.

 

Максимальный срок хранения материала 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

     Сок предстательной железы:

 

После окончания массажа предстательной железы сок в количестве 0, 5-1 мл собирают в одноразовую сухую пробирку типа “Эппендорф”. При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится сок предстательной железы) в количестве 10 мл (правила забора мочи смотрите выше).

 

Максимальный срок хранения 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

     После окончания массажа предстательной железы сок в количестве 0, 5-1 мл собирают в одноразовую сухую пробирку типа “Эппендорф”. При невозможности получить сок, сразу после массажа собирают первую порцию мочи (в которой содержится сок предстательной железы) в количестве 10 мл (правила забора мочи смотрите выше).

 

Максимальный срок хранения 1 сутки в холодильнике при температуре +4°С – +8°С.

 

                                                      14


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2019-05-06; Просмотров: 246; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.028 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь