Длительное хранение спермы при сверхнизких

Температурах

   Наиболее значительным достижением в области искусственного осеменения явилась разработка мето­да глубокого замораживания и длительного хранения спермы.

Способность спермиев млекопитающих перено­сить замораживание известна с давних пор. И.И. Ива­нов в 1907 г. наблюдал восстановление колебательно­го движения спермиев жеребца после охлаждения до -15°С. Замораживание спермы сельскохозяйственных животных до -79°С осуществил И.В. Смирнов в 1947-1949 гг. под руководством академика В.К. Милованова. Он помещал небольшие порции цельной спермы в пакетики из алюминиевой фольги и выдерживал на поверхности твердой двуокиси углерода. После оттаи­вания восстанавливали подвижность 15—30% спермиев. Автор впервые в мире получил потомство при ис­пользовании замороженной спермы кролика, барана, быка. Эта работа впоследствии была признана откры­тием.

В 1948 г. группа английских биологов из Кемб­риджа, возглавляемая С. Полджем, при разработке метода замораживания спермы петухов случайно об­наружила криозащитные свойства глицерина. Авто­ры сумели правильно осмыслить и реализовать это открытие, причем уже в 1952 г. на  Втором междуна­родном конгрессе по искусственному осеменению животных сделали сенсационное сообщение о техни­ке замораживания спермы быков в среде с глицерином.

    Кембриджская технология была очень громоздкой. Сперму разбавляли в два этапа средой специального состава и после  12-часовой эквилибрации расфа­совывали в стеклянные ампулы. Замораживание про­водили в ступенчатом режиме с помощью управляе­мой компьютером программы.

    В 1964 г. группа ученых из Японии (Т.Нива и др.) предложили оригинальный способ замораживания спермы в гранулах. Свежеполученную сперму разбавляли в 2-6 раз лактозо-глицерино-желточной средой, переносили на 3 ч в бытовой холодильник. Затем накапывали с помощью шприца в лунки на блоке сухого льда (Т - 78^оС). Образовавшиеся гранулы объемом 0, 15-0, 20 мл ссыпали в полотняный мешочек и переносили на постоянное хранение в сосуд Дьюара с жидким азотом.

    В нашей стране для замораживания спермы быков в гранулах было предложено использовать более дешевый и доступный хладоагент – жидкий азот. В таком варианте подготовленную к криоконсервации обычным путем сперму накапывали в лунки предварительно охлажденной погружением в жидкий азот фторопластовой пластины, расположенной над поверхностью (в парах) жидкого азота. Для облегчения и унификации процесса замораживания предлагались различные устройства, вплоть до полуавтоматической установки (В.А.Середин, 1973).

    Помимо исключительной простоты и технологической эффективности данного способа, привлекательной стороной было то, что он обеспечивал сохранение жизнеспособности 40-50% спермиев и давал вполне приемлемые результаты по оплодотворяемости коров и телок. Это и предопределило широкое его внедрение в практику. Так, в нашей стране он вскоре стал основным и сохранял свои позиции вплоть до конца прошлого столетия.

     Широкое производственное применение способа криоконсервации спермы в необлицованных гранулах на протяжении трех десятилетий позволило вскрыть и осознать недостатки и бесперспективность данной технологии. Это прежде всего отсутствие герметизации и индивидуальной идентификации спермодоз; следовательно, нельзя избежать снижения ее санитарных и биологических качеств в процессе хранения и что еще хуже – обезлички гранул.

     По указанным причинам правила работы племпредприятий ограничивают срок хранения спермы в необлицованных гранулах пятью годами. Из этого следует, что такая сперма не может быть использована в селекционных программах, включающих оценку быков по качеству потомства, при которой начало реализации запасов замороженной спермы возможно лишь спустя 4-5 лет.

     Данная технология также не отвечает современным требованиям автоматизации, механизации и гигиены трудоемких процессов при крупномасштабном производстве.

     К настоящему времени она полностью вытеснена способом криоконсервации спермы в тонкостенных соломинках (пайетах), изготовляемых из синтетических материалов (ацетилцеллюлоза, поливинилхлорид).

     Этот способ был детально разработан и запатентован в 1968-1969 гг. Р. Кассу (Франция).

     Основные элементы данной технологии следующие. Свежеполученную сперму быка разбавляют средой «Лецифос» или «Лецифос-Плас» или «Криоцифос» с таким расчетом, чтобы в спермодозе объемом 0, 5 или 0, 25 мл после оттаивания содержалось 10 млн подвижных спермиев. Затем под вакуумом ее расфасовывают в пайеты, один конец которой затем герметизируют поливиниловым спиртом, а другой — термосваркой. В дальнейшем пайеты маркируют, выдерживают 2 ч в воде, имеющей температуру 5^оС, замораживают в парах жидкого азота, ссыпают в ванну с жидким азотом, связывают в пучки по 100 штук. Пучки помещают в пеналы из полимерных материалов и закладывают на хранение в стационарный крупногабаритный сосуд Дьюара.

     Все процессы технологической обработки спермы, включая расфасовку, маркировку, замораживание, механизированы или осуществляются в автоматическом режиме, что обеспечивает высокую производительность и гигиену труда. Важно отметить, что данная технология исключает контакт спермы с внешней средой от момента ее взятия до введения в цервикальный канал коровы или телки, т.е. безупречна с санитарной точки зрения.

     Варианты замораживания спермы в пайетах в разное время предлагали отечественные ученые: П.И.Пакенас и др. (1975), Е.М.Платов и др. (1976), И.Х.Хабибуллин (1977), но они отличались лишь размерами и объемом пайет, материалом для герметизации заключенной в них спермодозы; с технологической же точки зрения не имели конкурентных преимуществ перед классическим вариантом.

Криоконсервация спермы хряка. Разработка практически приемлемого способа за­мораживания спермы хряков сопряжена с большими специфическими трудностями: большие объемы спер­мы, повышенная чувствительность к низким темпера­турам, особенности метаболизма.

В 1972 г. Рихтер и Лидике (ФРГ) сделали сенса­ционное сообщение о разработанном ими способе замо­раживания спермы хряков и полученном от использо­вания такой спермы приплоде. Эта публикация яви­лась толчком к проведению подобных исследований в других странах.

Вскоре в США была принята технология замора­живания спермы хряков, разработанная в Белтсвилле. По этой технологии свежеполученную сперму центри­фугируют 10 мин, плазму удаляют. Осадок разбавля­ют белтсвиллской средой без глицерина, охлаждают до 5°С в течение 2 ч. Затем добавляют среду, содержа­щую 2% глицерина, и сразу же замораживают в гра­нулы по 0, 15-0, 2 мл на блоках сухого льда. Гранулы ссыпают в тубы объемом 10 мл и хранят в жидком азоте.

По отечественной технологии, предложенной В.К. Миловановым, для разбавления используют как цельный эякулят, так и густую фракцию спермы или центрифугат. Свежеполученную сперму выдерживают 1 ч при температуре 15-26 °С, разбавляют в соотноше­нии 1: 1 трис-Nа-ЭДТА-средой.

Из разбавленной спермы отсасывают воздух ва­куумным способом, насыщают водородом, выдержива­ют 3 ч в анаэробных условиях при 16-18°С, переносят на 1 ч в холодильник с температурой    5 °С, затем на 30 мин — в ледяную воду. Замораживают на охлаж­денной до -100⁰С фторопластовой пластине, при этом получают гранулы объемом 0, 5 мл.

При искусственном осеменений свиней заморо­женной спермой оплодотворяемость составляет около 50%, многоплодие —   8, 4-11, 7 поросенка. Несмотря на вполне удовлетворительные показатели оплодотворяемости и многоплодия, искусственное осеменение свиней замороженной спермой не получило широкого практического применения. Это объясняется громозд­костью технологии, большими потерями спермы в процессе технологической обработки (из эякулята уда­ется заготовить лишь одну спермодозу). На данном этапе ее применение экономически оправданно лишь в племенной работе, в частности, при создании нужных генотипов баз завоза в хозяйство хряков.

Криоконсервация спермы барана. Разработка приемлемого для практических це­лей способа замораживания спермы баранов стала воз­можной лишь после того, как были изучены особенности метаболизма половых клеток.

В отличие от других видов сельскохозяйствен­ных животных, сперма барана не содержит природного антиоксиданта, который защищал бы спермии от супероксида 0₂Н, образующегося в процессе жизнеде­ятельности спермиев и являющегося весьма активным
окислителем. 

В связи с отмеченной особенностью, в процессе криообработки спермы барана происходит перекисное окисление липидов, что приводит к разрушению белково-липидных комплексов в мембранах половых кле­ток, повреждению акросомы. Введение в состав сред для спермы барана антиоксидантов (эхинохром, коламин, токоферол, ИХФГАН-3) не только предупрежда­ет отмеченные криогенные повреждения, но и повы­шает устойчивость спермиев к холодовому шоку.

В.К. Милованов для глубокого замораживания спермы барана предложил среду ВИЖ; в ее состав входят сахароза, ЭДТА, глицерин, желток куриных яиц, токоферол (или эхинохром), спермосан.

Е.М. Платов разработал рецепт лактозо-желточно-гуммиарабик-трис-цитратной (ЛЖГТЦ) среды; ее выпус­кают в виде сухих заготовок. Сперму барана разбавляют ЛЖТЦ-средой в 3-4 раза, эквилибрируют 2-3 ч при тем­пературе 2-4°С, замораживают на фторопластовой плас­тине при температуре  - 80…- 90°С в виде гранул объемом 0, 2 мл. При использовании такой спермы в производ­ственных условиях оплодотворяемость составила 42%.

Сперму жеребцов разбавляют лактозо-хелато - циторатно-жел-точной средой в 5 раз, расфасовывают в по­липропиленовые трубки емкостью 10 мл (их использу­ют и как часть осеменительного прибора). После 2-ча­совой эквилибрации замораживают в парах жидкого азота. При использовании замороженной этим способом спермы зажеребляемость составляет около 60%.

Для разбавления и глубокого замораживания спермы баранов в разное время было предложено свыше десятка рецептов синтетических сред; среди них наиболее хорошо себя зарекомендовала на практике лактозо-желточно-гуммиарабико-трис-цитратно-глице-риновая – ЛЖГТЦГ (автор Е.М. Платов). Её выпускают в виде сухих заготовок. Сперму барана разбавляют ЛЖГТЦГ–средой в 3-4 раза, эквилибрируют 2-3 ч при температуре 2-4⁰С, замораживают на фторопластовой пластине при температуре ^- 80 … ^- 90⁰С в виде гранул объемом 0, 2мл. При использовании такой спермы в производственных условиях оплодотворяемость составила 42%.

За рубежом используют в основном ТГЖГ–среду, состоящую из 360 мМ трис-буфера, 33, 3 мМ глюкозы, 113, 7мМ лимонной кислоты, 18% желтка и 6% глицерина; замораживают в необлицованные гранулы либо пайеты.

Таблица 8

⇐ Предыдущая12131415161718192021Следующая ⇒

Поделиться: