Молекулярное строение антител

Молекула антитела имеет Y-образную форму и состоит из двух тяжелых (Н) и двух легких (L) цепей, связанных дисульфидными мостиками (исследования Дж.Эдельмана, выполненные с использованием меркаптоэтанола и некоторых других соединений, которые разрушают межцепьевые связи -S-S-, показали наличие данного факта).

Каждая молекула антитела имеет два одинаковых антигенсвязывающих Fab-фрагмента (fragment antigen binding), определяющих антительную специфичность, и один Fc-фрагмент (fragment constant) фрагмент, который не связывает антиген, но обладает эффекторными биологическими функциями. Он взаимодействует со «своим» рецептором на мембране различных типов клеток (макрофагов, тучных клеток, нейтрофилов), может активировать комплемент.

Концевые участки легких и тяжелых цепей молекулы иммуноглобулина вариабельны по составу (аминокислотным последовательностям) и обозначаются, соответственно, V_L и V_H области. Строение гипервариабельных участков определяет структуру активного центра антитела (антигенсвязывающий центр или паратоп). Антигенсвязывающий центр антител (паратоп) комплементарен антигеной детерминанте (эпитопу) по принципу «ключ-замок». Антиген свяжется антителом (ключ попадет в замок) только в том случае, если детерминантная группа антигена полностью вместится в щель активного центра антитела.

Легкие и тяжелые цепи состоят из отдельных блоков – доменов.

Домен – это гомологичный участок легкой или тяжелой цепи иммуноглобулина, состоящий из аминокислотных остатков и организованный в замкнутую сферу за счет дисульфидных связей.

В легких (L) цепях два домена – один вариабельный (V) и один константный (C). В тяжелых (H) цепях один V и 3 или 4 (в зависимости от класса иммуноглобулина) C домена.

Дрейер и Беннет в 1965 году высказали предположение об участии 2-х генов V и C в построении тяжелой и легкой цепей молекулы иммуноглобулина. Один из генов V той или иной группы взаимодействует с геном C той же группы, что реализуется в синтезе иммуноглобулинов определенной специфичности – теория «два гена – одна полипептидная цепь».

Антигенсвязывающий участок или активный центр антител, формируется при взаимодействии V_H и V_L – доменов. Изменения в последовательности аминокислотных остатков этих доменов от белка к белку определяет собственно меняющуюся специфичность антител.

Существуют легкие цепи двух типов – каппа и лямбда, они встречаются в разнообразных пропорциях в составе различных (всех) классов иммуноглобулинов.

Выявлено пять классов тяжелых цепей – альфа (с двумя подклассами), гамма (с четырьмя подклассами), эпсилон, мю и дельта. Соответственно обозначению тяжелой цепи обозначается и класс молекул иммуноглобулинов – IgА, IgG, IgE, IgM и IgD.

Именно константные области тяжелых цепей, различаясь по аминокислотному составу у различных классов иммуноглобулинов, в конечном результате и определяют специфические свойства иммуноглобулинов каждого класса. Константная часть молекулы (С) определяет гетерогенность иммуноглобулинов, т.е. те структурные особенности, которые позволяют делить всю группу белков на классы, подклассы, аллотипы и т.д. Вариабельность – это индивидуальная характеристика иммуноглобулинов, относящихся к одному и тому же классу, подклассу.

Известно пять классов иммуноглобулинов, отличающихся по строению тяжелых цепей, молекулярной массе, физико- химическим и биологическим характеристикам: IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. В составе IgG выделяют 4 подкласса ( IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 ), в составе IgA – два подкласса (IgA1, IgA2).

Структурной единицей антител является мономер, состоящий из двух легких и двух тяжелых цепей. Мономерами являются IgG, IgA (сывороточный), IgD и IgE. IgM – пентамер, IgA секреторный – димер. У полимерных иммуноглобулинов имеется дополнительная j (joint) полипептидная цепь, которая объединяет (полимеризует) отдельные субъединицы (в составе пентамера IgM и димера – секреторного IgA).

 

Основные биологические характеристики антител

1 Специфичность – способность антитела взаимодействовать с определенным (своим) антигеном (соответствие эпитопа антигена и активного центра антитела).

2 Валентность – количество способных реагировать с антигеном активных центров (это связано с молекулярной организацией – моно- или полимер). Иммуноглобулины могут быть двухвалентными (IgG) или поливалентными (пентамер IgM имеет 10 активных центров). Двух- и более валентные антитела называют полными антителами. Неполные антитела имеют только один участвующий во взаимодействии с антигеном активный центр (блокирующий эффект на иммунологические реакции, например, на агглютинационные тесты). Их выявляют в антиглобулиновой пробе Кумбса, реакции угнетения связывания комплемента.

3 Афинность – прочность связи между эпитопом антигена и активным центром антитела, зависит от их пространственного соответствия.

4 Авидность - интегральная характеристика силы связи между антигеном и антителами, с учетом взаимодействия всех активных центров антител с эпитопами. Поскольку антигены часто поливалентны, связь между отдельными молекулами антигена осуществляется с помощью нескольких антител.

5 Вариабильность структуры иммуноглобулинов. Все иммуноглобулины построены из разного количества сходных четырехцепочечных субъединиц и могут иметь варианты трех видов:

– изотипические варианты, обусловленные экспрессией гаметных генов, присутствующие у всех особей данного вида и кодирующие тяжелые и легкие цепи, а также «каркасные» аминокислотные остатки в составе их V-областей (подгруппы);

– аллотипические варианты, обусловленные внутривидовой аллельной изменчивостью;

– идиотипические варианты, представляющие разнообразие антигенсвязывающих центров (паратопов) и обусловленные, в частности, изменчивостью гипервариабельных V-областей.

Даже тогда, когда антитела к конкретному антигену относятся к одному классу, субклассу и даже аллотипу, они характеризуются специфическими отличиями друг от друга ( идиотипом ). Это зависит от особенностей строения V- участков H- и L- цепей, множества различных вариантов их аминокислотных последовательностей.

 

Моноклональные антитела

Моноклональные антитела являются продуктами одного из множества клонов антителообразующих клеток (АОК) и обладают строгой специфичностью по отношению к определенной антигенной детерминанте (эпитопу) того или иного антигена. Технология получения моноклональных антител разработана Георгом Келлером и Цезарем Мельштаймом, которые в 1984 г. получили Нобелевскую премию за их открытие. Сущность метода заключается в получении неограниченно долгоживущего клона клеток, продуцирующего антитела узкой специфичности. Для этого лабораторные животные (млекопитающие, например, мыши) подвергаются иммунизации, обычно, путем нескольких инъекций антигена в течение 1-2 месяцев. Затем из селезенки получают клетки, из которых выделяют лимфоциты. Их сливают с клетками миеломы, которую выбирают так, чтобы она сама по себе не производила антитела и не имела гена гипоксантин-гуанинфосфорибозилтрансферазы (HHPТ), что делает ее чувствительной к селектирующему агенту НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Слияние клеток производится с помощью нарушающего мембраны агента, такого, как полиэтиленгликоль или вирус Сёндай.

После слияния клетки в течение 10-14 дней поддерживают в среде, содержащей НАТ (гипоксантин, аминоптерин и тимидин). Аминоптерин блокирует синтез нуклеотидов, поэтому клетки материнской миеломы погибают. В отличие от миеломы, гибридные клетки и В-лимфоциты, имеющие ген ГГФТ, выживают за счет использования гипоксантина как источника пуринов, но продолжительность жизни обычных лимфоцитов ограничена, и через несколько недель в культуре остаются только клетки гибридомы. Поскольку не все из них образованы путем слияния миеломы с лимфоцитами, производящими нужные антитела, клетки делят на линии, которые поддерживают в отдельных ячейках 96-луночных планшетов. Далее в среде над клетками определяют антитела и отбраковывают клеточные линии, не производящие антитела или недостаточно быстро размножающиеся. При достаточно хорошем разведении клеточной суспензии в одну лунку попадает не более одной гибридной клетки, но для гарантированного качества и стабильности культуры отобранные клеточные линии могут быть еще раз клонированы с тем, чтобы антитела производились потомками одной гибридной клетки, то есть были моноклональными.

Клонированную культуру гибридомы затем пересевают из лунки 96-луночной плашки в сосуды большей емкости для размножения, хранения в жидком азоте и получения большего количества антител для дальнейших исследований. Из культуральной среды можно получить от 1 до 60 µg/ml моноклональных антител. Большее количество можно получить путем введения клеточной суспензии в брюшную полость мышей, где гибридома размножается подобно раковым клеткам материнской миеломы, секретируя антитела во внутриполостную жидкость с образованием асцита (скопление жидкости в брюшной полости).

Моноклональные антитела могут использоваться для разных практических целей:

• для идентификации клеток – выявления Т- и В-лимфоцитов и других клеток, определения их свойств;

• для осуществления современных радиоиммунных, иммуноферментных и иммунолюминесцентных методов выявления антигенов и антител;

• для определения локализации антигенов в организме и доставки к ним (например, в опухоль) лекарственных веществ, присоединенных к антителам;

• для приготовления иммуносорбентов, позволяющих выделить ели удалить из организма антигены или клетки данной специфичности.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: