КРАТКАЯ ХАРАКТРИСТИКА МЕТОДОВ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ ПНЕВМОЭНТЕРИТОВ ТЕЛЯТ И ПОРОСЯТ

Выделение вирусов из биологического материала

 

Для выделения вирусов-возбудителей пневмоэнтеритов телят (инфекционного ринотрахеита, диареи, парагриппа-3, респираторно-синцитиального вируса, рота-, корона-, парво- и аденовирусов) и поросят(вирусы трансмиссивного гастроэнтерита свиней, ротавирусная и парвовирусная инфекции) применяют первично-трипсинизированные и перевиваемые культуры клеток почек эмбрионов коровы, почек телят, тестикул бычков, легких эмбрионов коров, селезенки эмбрионов, почки поросенка, легких эмбриона свиней и т.д.

Вируссодержащий материал (слизистая оболочка носа, пораженного кишечника, преджелудков, селезенки, легких, трахеи), полученный в виде 10—20%-ной суспензии и приготовленный при помощи центрифугирования при 3, 0—5, 0 тыс.об./мин., после 4-часовой экспозиции с антибиотиками при 4^°С вносят по 0, 1—0, 2 мл не менее чем в 4—5 пробирок с культурой клеток.

Флаконы с фекалиями замораживаются при -20^°С в течение 18—24 часов, затем оттаивают при 37°С и центрифугируют при 5 тыс.об./мин. в течение 20 мин. Надосадочную жидкость отсасывают в стерильные пробирки, куда вносят по 1000 ЕД пенициллина и стрептомицина, 50 ЕД нистатина и выдерживают в течение 2—4 часов при +2+4°С, дополнительно центрифугируют и после отрицательного бактериологического контроля используют для заражения культуры клеток. Зараженные и контрольные пробирочные культуры ставят на инкубацию при 37^°С на 7—10 суток до появления ЦПД. В случае, если в первом пассаже ЦПД будет отсутствовать, необходимо провести 3—4 слепых пассажа. При наличии в исследуемом материале цитопатогенных штаммов вирусов, возбудителей пневмоэнтеритов телят, в клеточном монослое обнаруживается ЦПД, характерное для каждого из вирусов.

Идентификацию выделенных цитопатогенных изолятов вирусов проводят реакциями нейтрализации, иммунодиффузии, связывания комплемента, иммунофлюоресценции, иммуноферментного анализа.

Реакция нейтрализации

Реакция биологической нейтрализации вируса (РН), основанная на способности специфических антител достаточно прочно соединяться с вирусной частицей, начала применяться еще на заре вирусологии. В результате взаимодействия между вирусом и антителом происходит нейтрализация инфекционной активности вируса вследствие блокады антигенных детерминант, ответственных за соединение вирусных частиц с чувствительными клетками. В результате вирус утрачивает способность размножаться в чувствительных к нему биологических системах in vitro и in vivo. Несмотря на внедрение в вирусологических лабораториях многих современных методов изучения биологической активности вируса и процессов его взаимодействия с антителами, реакция нейтрализации остается одним из основных серологических тестов. Она позволяет идентифицировать, а затем определить типовую принадлежность выделенного вируса.

Результаты реакции нейтрализации становятся очевидными после того, как смесь вируса с гомологичными ему антителами после определенной по времени экспозиции будет внесен в чувствительную биологическую систему (тканевая культура клеток, куриный эмбрион, организм восприимчивого животного), где вирус может размножаться и вызывать поддающиеся учету изменения и которые будут подавлены частично или полностью в присутствии антител.

В диагностике вирусных респираторных инфекций крупного рогатого скота реакция нейтрализации нашла широкое распространение и до сих пор остается классическим методом как для идентификации выделенных вирусов, так и для обнаружения вируснейтрализующих антител.

Для постановки реакции нейтрализации при диагностике пневмоэнтеритов телят в качестве биологических объектов используют те же культуры клеток, что и для выделения вирусов. Реакцию нетрализации для идентификации вирусов ставят с заранее известными противирусными сыворотками, а для выявления антител в биологическом материале - с заранее известными вирусами.

Постановка реакции нейтрализации при идентификации вируса инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота требует наличия:

-специфической сыворотки против инфекционного ринотрахеита;

-вируссодержащего испытуемого материала, свободного от микробов;

-культуры клеток ПЭК, ПТ, ТБ или МДБК;

-контрольной отрицательной сыворотки;

-питательной вирусологической среды и вспомогательных растворов.

Перед постановкой реакции сыворотки разводят питательной средой до 1: 10 и инактивируют в течение 30 мин. при температуре 56°С. Все манипуляции осуществляют в строго стерильных условиях.

В первый ряд стерильных пробирок (7 шт) вносят по 2 мл специфической сыворотки, во второй ряд - по 2 мл отрицательной.

После приготовления десятикратных разведений вируссодержащего материала (конечное разведение 10^-7) с использованием питательной среды вносят по 2 мл каждого разведения в два ряда с сыворотками. Пробирки тщательно встряхивают и выдерживают при 37°С в течение двух часов. Затем из каждой пробирки со смесью вируса и сыворотки по 1 мл переносят в 4 пробирки с культурой клеток и после адсорбции вируса на клеточном монослое инкубируют их при 37°С, ежедневно просматривают на наличие ЦПД. Окончательный учет результатов реакции осуществляют на 5—7 день.

Видовую принадлежность вируса и его титр определяют по разности показателей между отрицательной и положительной сыворотками. Разница должна быть не менее чем на 2 lg.

Реакция связывания комплемента

Реакция связывания комплемента является одной из традиционных серологических реакций, применяемых для диагностики многих вирусных заболеваний, а также составляет основу некоторых других методов выявления противовирусных антител. Хотя реакция нейтрализации, торможения гемагглютинации, непрямой гемагглютинации, иммуноферментный анализ превосходят реакцию связывания комплемента по чувствительности, однако простота методики, раннее обнаружение антител, а также выявление вирусных антигенов, не обладающих гемагглютинирующими свойствами, объясняют ее широкое применение в вирусологических исследованиях.

Для ее постановки не требуется такая высокая степень концентрации и чистоты антигенных препаратов, которые необходимы для ряда других иммунологических реакций. Кроме того, групповая специфичность комплементсвязывающих антигенов многих вирусов позволяет использовать реакцию связывания комплемента при массовой диагностике: эта реакция не выявляет штаммовых различий, приобретает особую ценность при изучении антигенных взаимосвязей между вирусами.

Само название в значительной мере отражает суть метода, состоящего из двух отдельных реакций. На первом этапе в реакции участвуют антигены и антитела (один из этих компонентов заранее известен), а также комплемент в оттитрованном количестве. При соответствии антигена и антител их комплекс связывает комплемент, что выявляется на втором этапе с помощью индикаторной системы (смесь бараньих эритроцитов и антисыворотки к ним). Если комплемент связался при взаимодействии антигена и антител, то лизис бараньих эритроцитов не происходит (положительная реакция связывания комплемента). При отрицательной реакция связывания комплемента несвязанный комплемент способствует гемолизу, по которому судят о резуль­татах реакции.

Основными компонентами реакции связывания комплемента служат антигены (известные или выявляемые), антитела (известные антисыворотки или исследуемые сыворотки), комплемент, гемолитическая сыворотка и эритроциты барана; в качестве разбавителя используют изотонический раствор натрия хлорида (pH 7, 2—7, 4) или различные буферные растворы. Антигены и сыворотки могут обладать антикомплементарностью, т.е. способностью адсорбировать комплемент, что задерживает гемолиз и искажает результат реакции.

Антигены для РСК готовят из органов зараженных животных, аллантоисной или амниотической жидкости зараженных куриных эмбрионов, а также культуральной жидкости после культивирования вирусов в тканевых культурах клеток. В антигенных препаратах всегда содержится много балластных веществ из клеток животных или культур ткани, что может также исказить результаты реакции.

Полученные вирусные антигены инактивируют, определяют рабочую дозу, а также антикомплементарные и гемолитические свойства. После этого антиген титруют в присутствии комплемента.

Вторым основным компонентом при постановке реакции является комплемент. Этим термином обозначают сложную систему белков и факторов, присутствующих в крови животных и человека. Обычно в реакции связывания комплемента применяют сыворотку крови морских свинок. Активность (титр) комплемента — это его наименьшее количество, в присутствии которого гемолизин вызывает полный гемолиз используемой гемолитической системы.

Для выявления комплемент-связывающих антител к вирусам проводят обязательную инактивацию сыворотки для устранения комплемента при 56⁰С в течение 30 мин. В качестве референс-сывороток обычно используют сыворотки иммунизированных животных. Причем для иммунизации применяют вирусные антигены, тщательно очищенные от тканевых примесей, так как к противном случае возникает выраженная неспецифическая реакция.

Обязательным компонентом реакции связывания комплемента является гемолитическая система, в которую входят эритроциты барана и гемолитическая сыворотка, полученная гипериммунизацией кроликов эритроцитами барана.

Для постановки реакции связывания комплемента используют следующие модификации: микрометод реакции связывания комплемента в микротитраторе системы Такачи, реакцию дли­тель­­ного связывания комплемента, реакцию непрямого связывания ком­племента, реакцию связывания комплемента в геле, реакцию свя­­зывания комплемента микрокапельным методом, реакцию связыва­ния комплемента на твердой основе.

Хотя чувствительность реакции связывания комплемента невысокая, однако она имеет высокую специфичность. В этой связи она широко применяется для диагностики вирусных пневмоэнтеритов молодняка крупного рогатого скота.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА)

Использование сорбированных диагностических препаратов основано на постоянно реализуемом в природе принципе иммунологического распознавания поверхностных структур. С этой точки зрения нет принципиальных различий между использованием, например, микробной клетки или искусственного носителя, нагруженных антигеном (антителами). В качестве основы сорбированных препаратов применяются различные носители — микробные клетки, эритроциты, латекс, бентонин, холестерин, сефадекс, дерматол, активированный уголь, споры грибов и т.д.

После работ А.Т.Кравченко (1945) наибольшее распространение в качестве носителя антигена или антител получили лишенные жизнеспособности и фиксированные различными химическими реагентами эритроциты. На принципе использования в качестве носителя антигена эритроцитов (как нативных, так и фиксированных) широкое распространение получила реакция непрямой (пассивной) гемагглютинации.

Предложение об использовании реакции непрямой гемагглютинации (РНГА) в диагностических целях возникли на базе предварительно развитых знаний о высокой сорбиционной активности эритроцитов. По сравнению со многими другими носителями антигенов и антител в реакции непрямой гемагглютинации эритроциты имеют определенные преимущества. Во-первых, в изотонических солевых растворах они образуют довольно стойкое сцепление и не оседают за короткое время. Во-вторых, эритроциты одного и того же вида животных одинаковы по размеру. И, наконец, эритроциты сравнительно легко непосредственно или в результате специальной обработки присоединяют различные серологически активные компоненты.

Создание эритроцитарных диагностикумов из стабилизированных эритроцитов позволяет преодолеть те трудности, которые возникают при использовании нативных эритроцитов.

При исследовании эритроцитов, обработанных различными фик­сирующими веществами, установлены некоторые их общие свойства:

— по морфологии они практически не отличаются от свежих;

— не гемолизируются в гипотонических растворах, в воде и после замораживания-оттаивания;

— могут быть лиофильно высушены;

— их поверхностные структуры сохраняют способность химически модифицироваться (например, танином, диазосоединениями) и вступать в реакцию с антигенами и антителами.

Главный критерий качества фиксированных эритроцитов — возможность их использования для получения сенсибилизированных препаратов при отсутствии неспецифического склеивания в стабилизирующих жидкостях.

Подготовка поверхности эритроцитов с целью повышения сорбиционной способности к антигенам имеет важное значение при конструировании диагностических препаратов. Особенно широкое распространение получила обработка эритроцитов танином.

Под его влиянием изменяются антигенные свойства эритроцитов (проницаемость, скорость оседания), повышается их устойчивость к гемолитическому воздействию некоторых жирных кислот. Достигается, однако, главное — танизированные эритроциты обладают значительно большей сорбиционной емкостью белков, что широко используется в настоящее время при изготовлении высококачественных антигенных и антительных диагностикумов.

Наряду с танизацией эритроцитов, для изготовления эритроцитарных диагностикумов и подготовки носителя антигена применяются такие химические реагенты, как бромелин, триопсин, перйодат калия, которые также модифицируют мембраны эритроцитов.

После подготовки поверхности эритроцитов идет наиболее важный процесс — процесс гемосенсибилизации — окончательный этап изготовления эритроцитарных диагностикумов.

Для упрочения связи между носителем и антигеном применяются различные конъюгирующие вещества — бисдиазобензидин, дифлуородинитробензин, хлористый циан, хлористый и уксуснокислый кадмий, хлорид брома, формальдегид, глютаровый альдегид, бромциан, риванол, амидол и др.

Использование конъюгирующих веществ способствует устранению тех недостатков, которые имеют танизированные эритроциты, применяемые для сенсибилизации без конъюгирующих веществ.

Наиболее широкое применение нашли такие конъюгирующие вещества, как хлорид хрома, глутаровый альдегид, диазоль черный С, амидол. Процесс сенсибилизации с помощью хлорида хрома происходит очень быстро — от 4 до 10 мин., чем привлекает внимание исследователей. При этом используются концентрации хлорида хрома от 0, 05 до 2%, pH — не ниже 5, 0 при температуре реакционной смеси 20—25⁰С. В процессе сенсибилизации хлоридом хрома активизируются карбоксильные группы белков мембраны эритроцитов. В результате этого образуется ковалентная связь между мембраной эритроцитов и сенситином.

Реакция непрямой гемагглютинации обладает высокой специфичностью, поскольку склеивание эритроцитов наступает в результате взаимодействия антигена с антителами, адсорбированными на эритроцитах. Отличительной ее особенностью является высокая чувствительность: в ней выявляется 0, 02-0, 05 мкг белка антител. По чувствительности она значительно превосходит реакции иммунодиффузии, иммунофлуоресценции, радиальной иммунодиффузии, связывания комплемента, нейтрализации. РНГА менее чувствительна, чем методы радиоиммуноэлектрофореза, определения количества белка радиоактивных антител в иммуносорбенте, иммуноферментного анализа.

К достоинствам РНГА следует отнести достаточно высокую воспроизводимость, простоту выполнения, потребность в минимальных количествах ингредиентов, особенно при использовании микрометода.

РНГА в последние годы нашла широкое применение при диагностике инфекционного ринотрахеита, диареи, аденовирусной инфекции, рота- и коронавирусной инфекции, парагриппа-3 и респираторно-синцитиальной инфекции.

Приводим пример изготовления и применения эритроцитарного диагностикума для выявления антител к рота- и коронавирусной инфекции.

Методика приготовления антительных диагностикумов для выявления рота- и коронавирусных антигенов в РНГА состоит в следующем: получение суспензии эритроцитов; фиксация их акролеинов; танизация, позволяющая получить стабильную сорбцию необходимого белка на эритроцитах; сенсибилизация танизированных эритроцитов иммуноглобулинами; определение специфичности приготовленного диагностикума. Приготовление суспензии эритроцитов осуществляется путем отбора крови клинически здорового барана в колбу со стеклянными бусами. После дефибринирования крови эритроциты должны быть отмыты 3—5 раз изотоническим (0, 9%-ным) раствором натрия хлорида путем центрифугирования в течение 15—20 мин при 400g.

В целях стабилизации эритроцитов проводится их обработка акролеином. Как известно, его действие несколько мягче, чем формальдегида, и обеспечивает стабильность и более высокую активность эритроцитов. Для этого равные объемы 10%-ной взвеси эритроцитов смешивают с 0, 2%-ным раствором акролеина, приготовленного на фосфатном буферном растворе (ФБР) с рН 7, 2. Полученную суспензию выдерживают в течение 30 мин при 37°С, тщательно перемешивая, с последующим освобождением от акролеина многократным центрифугированием в течение 5 мин при 600—800gдо полного исчезновения специфического запаха. Преимущество приготовленных таким образом эритроцитов заключается в том, что они заготавливаются впрок, могут длительное время сохраняться, не подвергаясь гемолизу.

В дальнейшем стабилизированные эритроциты в 10%-ной концентрации выдерживают при 2—4°С в ФБР с рН 7, 2 в течение двух месяцев.

Для повышения сорбционной способности и осаждаемости эритроцитов необходимо провести их танизацию путем смешивания равных частей 10%-ной суспензии отмытых эритроцитов и раствора танина на ФБР и рН 7, 2 в разведении 1: 30000. Смесь тщательно перемешивают и выдерживают при 37⁰ С в течение 15 мин, после чего эритроциты тщательно отмывают от танина дважды в ФБР с рН 7, 2 и трижды изотоническим раствором натрия хлорида с рН 7, 2—7, 4.

Оптимальным сроком гарантирующим получение качественных эритроцитарных диагностикумов является их сенсибилизация в течение 24—48 часов после их обработки танином.

В процессе изготовления диагностикумов в качестве растворителя и консерванта используют 0, 3%-ный фенолизированный изотонический раствор натрия хлорида с 0, 1%-ной нормальной кроличьей или лошадиной сывороткой, предварительно инактивированной при 56°С в течение 30 мин и адсорбированной нормальными эритроцитами барана при 37°С в течение 30 мин.

Сенсибилизацию танизированных эритроцитов следует осуществлять гипериммунной сывороткой соответственно против рота- и коронавирусов крупного рогатого скота (производимой во Всероссийском НИИ экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко). При этом сенсибилизирующая доза (концентрация белка ) антиротавирусной иммунной сыворотки составляет 280 мкг/мл, а иммунной сыворотки к коронавирусу - 260 мкг/мл.

Сенсибилизацию проводят, смешивая равные объемы танизированных эритроцитов и предварительно прогретой в течение 30 мин при 56⁰С иммунной сыворотки в оптимальной концентрации. Кроме того, вносят 3 части изотонического раствора натрия хлорида с рН 7, 2 и 5 частей 0, 1%-ного раствора хлорида хрома. Смесь, периодически помешивая, выдерживают при комнатной температуре в течение 5 мин. По истечении указанного времени смесь тщательно отмывают с использованием ФБР с рН 7, 2, а затем приготовленные эритроцитарные диагностикумы ресуспендируют в консерванте до 1%-ной концентрации. Приготовленный диагностикум сохраняет свои основные качества в течение 8 мес., при условии хранения его при 4°С.

На всех этапах изготовления диагностикумов осуществляют контроль на самоагглютинацию. Специфичность приготовленных диагностикумов определяют путем постановки РНГА, где в качестве антигенов использовали стандартные диагностикумы вирусов ИРТ, ПГ-3, аденовирусов, вирусной диареи, а также антигенов рота- и коронавирусов.

При постановке РНГА готовят последовательные двойные разведения исследуемого вируссодержащего материала (20—50%-ная суспензия проб фекалий), а затем в каждую лунку вносят равный объем эритроцитарного диагностикума. Плашки следует тщательно встряхнуть несколько раз, оставить при комнатной температуре до полного оседания эритроцитов в контроле. Показатель положительной реакции - агглютинация эритроцитарного диагностикума с интенсивностью агглютинации на 2+ в титре 1: 4 и выше.

 

Иммуноферментный анализ (ИФА). Обнаружение вирусных антигенов (на примере диагностики ротавирусной инфекции)

Иммуноферментный анализ, предложенный более двадцати лет назад на пересечении иммунохимии и инженерной энзимологии, стал в настоящее время одним из распространенных методов исследований. Явным преимуществом данного метода, к которому относятся простота выполнения, доступность и стабильность реагентов, экспрессивность и возможность автоматизации для проведения массовых анализов, является обеспечение его прочного положения в клинической биохимии при диагностике заболеваний растений и животных, в научных исследованиях.

Иммуноферментный анализ был предложен в начале 70-х гг. тремя независимыми группами исследователей — Engval, Pormann в Швеции, van Neamen, Schumes в Нидерландах, Rubenslen et al. в США. При этом методе антиген (или антитело), вступающие в иммунологическую реакцию, метится ферментом. По превращению ферментом добавляемого субстрата можно судить о количестве вступившего во взаимодействие компонента реакции антиген-антитело. Чувствительность иммуноферментного анализа позволяет определить минимальные количества (нанограммы) белка антигена или антител.

Обнаружение специфических антител в физиологических жидкостях играет важную роль в клинической диагностике широкого круга заболеваний как инфекционного, так и аутоиммунного характера. Для этих целей были разработаны ряд разнообразных методов, в том числе РСК, РНГА, РИФ, РЗГА, латекс-агглютинация. Применяя эти методы для количественного определения реагента, требуется титрование в серийных разведениях. Кроме того, одним из недостатков вышеуказанных тестов является трудоемкость, невысокая точность и значительный элемент субъективности. Это связанно с тем, что, как правило, сложно отличить с достаточной надежностью слабую положительную реакцию от отрицательной.

Благодаря иммуноферментному анализу появилась возможность проводить количественные измерения в широком диапазоне концентраций с использованием лишь единичного разведения сыворотки или плазмы. Этот метод позволяет легко различать по активности антитела, принадлежащие к различным классам иммуноглобулинов.

Правильный подбор соответствующих антигенов, связанных с носителями, подходящий антииммуноглобулиновый конъюгат, содержащий ферментную метку, позволяют создать системы тестирования множества различных антигенов, основанных на одном и том же наборе манипуляций.

Постановка твердофазного иммуноферментного анализа на полистироловых панелях с целью выявления противовирусных антител имеет следующие стадии:

-иммобилизация растворимых антигенов на твердой фазе;

-отмывание несвязавшегося антигена буферным раствором с детергентом;

-связывание активных центров твердой фазы инертным белком;

-взаимодействие иммобилизированных антигенов с исследуемыми антителами и образование комплекса антиген-антитело;

-выявление комплекса антиген-антитело с помощью антииммуноглобулиновой сыворотки или белка А золотистого стафилококка, меченных ферментом;

-выявление с помощью субстратной смеси количества связанного фермента.

После прохождения реакции ее учитывают визуально или спектрофотометрически.

Для выявления антигенов вирусов в биологических жидкостях также используют твердофазный иммуноферментный анализ. Для выявления вирусных антигенов наиболее часто используют метод двойных антител или “сэндвич”-вариант. При этом в лунки полистироловых панелей иммобилизируют специфический гамма-глобулин, выделенный из специфической к данному антигену сыворотки.

Стадии выявления антигена следующие:

-иммобилизация на твердой фазе антител; отмывание их избытка буферным раствором с детергентом; обработка лунок панели инертным белком; внесение исследуемого антигена; отмывание; внесение конъюгата антител с ферментом; внесение субстратной смеси; учет результатов реакции.

Кроме твердофазного иммуноферментного анализа, имеется еще и гистологический вариант, или иммунопероксидазная реакция. Данная реакция аналогична реакции иммунофлуоресценции, но отличается тем, что для постановки иммуноферментного анализа используются антитела, меченные не флуорохромом, а ферментом, а учет реакции проводится под обычным световым микроскопом.

В этом варианте иммуноферментного анализа используются антитела, меченные пероксидазой, так как молекулярная масса (40000) меньше, чем других ферментов и способствует лучшему проникновению пероксидазных конъюгатов через клеточные мембраны. Материалом для выявления вирусспецифических антигенов или вирусов с помощью иммунопероксидазного метода могут служить мазки-отпечатки из различных органов, парафиновые срезы, культура клеток, мазки крови.

При выявлении антигенов используют как прямой, так и непрямой иммунопероксидазные тесты. Для выявления вирусспецифических антигенов прямым иммунопероксидазным методом проводят следующие этапы: фиксация мазков-отпечатков или инфицированного монослоя, внесение конъюгата антител с ферментом, отмывание, внесение субстратной смеси и учет под микроскопом.

Различные варианты ИФА с целью выявления антигенов и антител нашли широкое применение для диагностики вирусных пневмоэнтеритов телят

Техника выявления ротавирусного антигена. Выпускаемый коммерческий набор для ИФА содержит все необходимы реагенты с указанием способа их приготовления и использования.

Из вспомогательных реактивов применяют:

калий фосфатно-буферный раствор, содержащий 0, 1М хлористого натрия с конечной рН 7, 2-7, 4 (ФБР);

твин-калий фосфатный буфер (ТФБР), содержащий 0, 05% твина-20 или твина-80 (на 1 литр ФБР добавляют 0, 5 мл твин-20 или твин-80). Раствор тщательно перемешивают на магнитной мешалке до полного растворения твина;

субстратная проявляющая смесь: 10 мг 5-аминосалициловой кислоты растворяют в 10 мл подогретой до 30—40°С дистиллированной воды, охлаждают и добавляют 0, 1 мл 0, 5 М натрия гидроокиси. Затем 10 мг перекиси водорода растворяют в 3-х мл дистиллированной воды и 1 мл вносят в 10 мл раствора 5-аминосалициловой кислоты.

На первом этапе в каждую лунку полистироловых плашек с плоским дном вносят по 0, 2 мл иммуноглобулинов в рабочем разведении.

Плашку закрывают крышкой, выдерживают в течение двух часов при 37°С или 16—18 часов при 4°С и по истечению экспозиции удаляют раствор иммуноглобулинов, промывая каждую лунку 3—4 раза ТФБР.

На втором этапе, где в качестве исследуемого материала используют 25—50%-ную суспензию фекалий в разведении 1: 50, готовят двойные разведения при визуальной оценке результатов реакции. При спектрофотометрическом учете результатов ИФА в раститровке нет необходимости. Плашки, в которых имеется по 0, 2 мл исследуемого антигена, тщательно встряхивают и инкубируют, как описано выше.

В дальнейшем в отмытые лунки вносят по 0, 2 мл антиротавирусного конъюгата в рабочем разведении при прежнем режиме взаимодействия реагентов.

На заключительном этапе в каждую лунку вносят по 0, 2 мл субстратной смеси и через 40—60 минут производят учет результатов реакции.

Следует отметить, что оптическая плотность образовавшегося продукта реакции прямо пропорциональна содержанию антигена в исследуемой пробе.

При визуальной оценке результатов ИФА, интенсивность окраски лунок с экспериментальными образцами сравнивают с окраской лунок с положительным и отрицательным контролем:

-интенсивное коричневое окрашивание - положительный результат;

-коричневое окрашивание - положительный результат;

-светло-коричневое окрашивание - сомнительный результат;

отсутствие окрашивания - отрицательный результат.

Пробы, при исследовании которых получен сомнительный результат, подлежат повторному исследованию. В случае получения двух сомнительных результатов реакции пробу считают отрицательной.

При инструментальной регистрации результатов иммуноферментного анализа, используются плашки с плоским дном и спектрофотометры или фотоэлектроколориметры при длине волны 450 нм. Позитивным результатом считается показатель реакции с оптической плотностью, превышающей на 0, 15 оптических единиц значение с отрицательным контролем.

Диагноз считают установленным в одном из следующих случаев:

—при выявлении вируса, выделенного из исходного вируссодержащего материала от телят с признаками патологии желудочно-кишечного тракта в культуре клеток, при наличии характерного ЦПД с последующей идентификацией в РН, РИФ, РИД, ИФА;

—при индикации характерных вирионов в исследуемом клиническом вируссодержащем материале методом иммуноэлектронной микроскопии;

—при обнаружении ротавирусных антигенов в пробах фекалий или соскобах со слизистой оболочки кишечника в РИФ, РИД, ИФА при наличии клинических и патологоанатомических показателей.

В случае выявления специфических антител при постановке диагноза учитывают наличие характерных симптомов болезни, отсутствие антител у коров-матерей как в крови, так и в молоке. С учетом указанного принимают окончательное решение по этиологии болезни.

У новорожденных телят ротавирусную инфекцию следует дифференцировать от коронавирусного энтерита, аденовирусной инфекции, вирусной диареи, эшерихиоза, парвовирусной инфекции, аназробной энтеротоксемии, а также патологии желудочно-кишечного тракта алиментарного происхождения.

 

Выявление антигена и обнаружение специфических антител в РИД (на примере ротавирусной инфекции)

Принцип двойной радиальной иммунодиффузии основан на взаимодействии растворов антигенов и антител, помещенных в интактный гель, диффундирующих навстречу друг другу и (в случает их соответствия) образования специфического преципитата в местах встречи реагентов.

Реакция иммунодиффузии используется для диагностки инфекционного ринотрахеита, вирусной диаери, аденовирусной инфекции, ротавирусной инфекции.

Материл: В качестве исследуемого материала при диагностике ротавирусной инфекции используются пробы фекалий больных телят, соскобы и содержимое тонкого кишечника животных, павших с выраженной патологией желудочно-кишечного тракта, пробы сыворотки крови животных-реконвалесцентов, а также молозиво и молоко коров-матерей больных телят. Пробы фекалий или содержимое кишечника в 25—50%-ной концентрации промораживают при минус 20° С в течение 18—20 часов, оттаивают и осветляют центрифугированием в течение 20 мин при 4000 об/мин. Супернатант используют в качестве испытуемого антигена.

Предварительно необходимо приготовить боратный буфер по прописи: натрия гидроокиси (NаОН) - 2, 0 г., кислота борная (Н₃ВО₃) - 9, 0., натрий хлористый (NаСl) - 70, 0 г, мертиолят (тиомерсал) - 0, 05 г, вода дистиллированная - до 1 литра.

При приготовлении агарового геля к 100 мл боратного буфера на гипертоническом растворе натрия хлорида добавляют 0, 7 г. агара “Дифко”. Флакон помещают в водяную баню с кипящей водой и выдерживают до полного расплавления агара (30—45 мин.).

Расплавленный агар вносят в чашки Петри, расположенные на строго горизонтальной поверхности в количестве 15 мл и оставляют их до полного застывания агара. Затем в агаре при помощи пробойника нарезают лунки диаметром 7 мм, расположенные на расстоянии 4 мм друг от друга. Агаровые пробки удаляют и, если в лунках накапливается влага, ее отсасывают перед внесением реагентов.

При необходимости индикации антигена в вируссодержащем материале в центральную лунку вносят специфическую сыворотку, в первую и четвертую вносят специфический ротавирусный антиген, а остальные заполняют исследуемым материалом. В качестве контроля параллельно испытуемый материал исследуют с отрицательной (контрольной) сывороткой.

Для обнаружения антител - в центральную лунку вносят специфический ротавирусный антиген, в первую и четвертую - специфическую сыворотку, в остальные - испытуемые сыворотки. Параллельно испытуемые сыворотки исследуют с контрольным отрицательным антигеном.

Компоненты следует вносить в лунки с таким расчетом, чтобы мениск был вогнутый и жидкость не растекалась по поверхности агара.

После заполнения всех лунок чашки Петри закрывают крышками и помещают во влажную камеру на 24—72 часа при комнатной температуре.

Реакцию считают положительной при наличии линии преципитации между лунками со специфической сывороткой и испытуемым антигеном, которая плавно переходит в контрольную линию между специфической сывороткой и положительным ротавирусным антигеном.

 

 

⇐ Предыдущая29303132333435363738Следующая ⇒

Поделиться: