Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии |
ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в реальном времени / по конечной точке
- метод основан на количественной флуоресцентно-гибридизационнойдетекцией специфических продуктов амплификации, в которых специальные красители используются для наблюдения за развитием амплификации. Используются термоциклеры (амплификаторы), совмещенные с детектором флуоресценции. В современных амплификаторах, предназначенных для детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени предусмотрены варианты детекциинесколь- ких флуоресцентных красителей (флуорофоров) одновременно. Детекция отдельного красителя происходит в определенном диапазоне-канале. Наиболее распространенные красители (каналы): FAM(синий) -наиболее чувствительный HEX (зеленый) ROX (оранжевый) Cy5 (фиолетовый) Cy3 (фиолетовый) Варианты проведения ПЦР: на 2 канала –FAMи HEX на 3 канала –FAM, HEX и ROX на 4 канала –FAM, HEX, ROX и Cy5 Мультиплексное ПЦР позволяет в одной пробирке искать сразу несколько возбудителей. При использовании 4 и более каналов возможно засвечивание мишеней. В тест-системах для ПЦР в реальном времени используются специальные зонды, состоящие из флуорофора(красителя), олигонуклеотида и гасителя-вещества, подавляющего флуоресценцию (свечение). Структура зонда:
флуорофор и гаситель разделены между собой 5-6 нуклеотидами-контактное тушение. В процессе амплификации ДНК-полимераза отсекает флуорфор от гасителя за счет экзонуклеазной активности и регистрируется флуоресцентный сигнал.
Флуорофор (краситель) поступает раствор в конце удлинения цепи (элонгации) и встроенный детектор улавливает сигнал флуоресценции. в конце каждого цикла, всего до 45 циклов. Сигнал флуоресценции в ходе амплификации возрастает пропорцианально количеству продуктов амплификации, что позволяет проследить ход реакции и судить об исходном количестве ДНК в образцах. Результаты флуоресценции(«разгорания») зонда фиксируются детектирующим устройством и обрабатываются компьютерной программой и выводятся на экран в виде обработанных кривых:
Флуоресценция положительных образцов усиливается с каждым циклом ампли фикации, а отрицательных образцов остается на базовом уровне. По мере расходования компонентов реакции кривая переходит в плато. В положительных образцах кривая амплификации переходит в плато до 40 цикла. После 40 цикла – отрицательный образец. Время амплификации от 1ч 20 мин до 2 ч 20 мин. Достоинства ПЦР-диагностики: · Высокая чувствительность метода · Возможность диагностики на ранних стадиях заболевания · Исследование различного материала от больных (плазма/сыворотка крови; соскобы со слизистых оболочек, ликвор, мокрота моча, эякулят, пунктаты) · Выявление широкого спектра возбудителей, включаятруднокультивиру- емые и некультивируемые бактерии, вирусы, простейшие. Недостатки ПЦР-диагностики: - Высокая стоимость оборудования -Одновременная амплификация ДНК как живого, так и погибшего м/о, элиминация возбудителя не ранее 4-8 недель -Возможность перекрестной реакции - Получение ложноотрицательных результатов при наличии ингибиторов ПЦР. - Определенная техническая подготовка персонала. - Вероятность контаминации: А) Перекрестной контаминации от пробы к пробе, возникающая в процессе обработки образцов или при раскапывании реакционной смеси. Б) Контаминация продуктами амплификации (ампликонами)
Преимущества ПЦР в реальном времени: · Амплификация и детекция проходят одновременно в закрытых пробирках, что снижает риск контаминации образцов. · Мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР. Возможность определения геномэквивалентов /мл образца. · Автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. · Не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, , что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории. · Высокая производительность, особенно при использовании автоматического нуклеовыделения и готовых реакционных смесей (ГРС) · Высокая чувствительность метода, в 2-3 раза выше детекции методом электрофореза. · Широкий спектр наборов для данного типа детекции: - Для диагностики ИППП и дисбиозов урогенитального тракта(Флороценоз) - Для диагностики ОКИ -Для диагностики ОРВИ -Для диагностики клещевых инфекций -Для диагностики герпесвирусных инфекций -Для диагностики вирусных инфекций-краснухи, парвовирусной В19 инфекции - Для диагностики коклюша, респираторного микоплазмоза и хламидофилеза. - Для диагностики бактериальныхнейроинфекций - Для диагностики ВПЧ-инфекции - Для диагностики туберкулеза -Для диагностики лептоспироза.
Генетическое секвенирование- расшифровка всей генетической последовательности НК. |
Последнее изменение этой страницы: 2017-05-05; Просмотров: 4660; Нарушение авторского права страницы