Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией продуктов амплификации в реальном времени / по конечной точке



 

- метод основан на количественной флуоресцентно-гибридизационнойдетекцией специфических продуктов амплификации, в которых специальные

красители используются для наблюдения за развитием амплификации.

Используются термоциклеры (амплификаторы), совмещенные с детектором

флуоресценции.

В современных амплификаторах, предназначенных для детекции продуктов ПЦР в режиме реального времени предусмотрены варианты детекциинесколь-

ких флуоресцентных красителей (флуорофоров) одновременно.

Детекция отдельного красителя происходит в определенном диапазоне-канале.

Наиболее распространенные красители (каналы):

FAM(синий) -наиболее чувствительный

HEX (зеленый)

ROX (оранжевый)

Cy5 (фиолетовый)

Cy3 (фиолетовый)

Варианты проведения ПЦР:

на 2 канала –FAMи HEX

на 3 канала –FAM, HEX и ROX

на 4 канала –FAM, HEX, ROX и Cy5

Мультиплексное ПЦР позволяет в одной пробирке искать сразу несколько

возбудителей.

При использовании 4 и более каналов возможно засвечивание мишеней.

В тест-системах для ПЦР в реальном времени используются специальные

зонды, состоящие из флуорофора(красителя), олигонуклеотида и гасителя-вещества, подавляющего флуоресценцию (свечение).

Структура зонда:

Флуорофор Олигонуклеотид Гаситель


флуорофор и гаситель разделены между собой 5-6 нуклеотидами-контактное

тушение.

В процессе амплификации ДНК-полимераза отсекает флуорфор от гасителя

за счет экзонуклеазной активности и регистрируется флуоресцентный сигнал.

 

 

Флуорофор (краситель) поступает раствор в конце удлинения цепи (элонгации)

и встроенный детектор улавливает сигнал флуоресценции. в конце каждого цикла, всего до 45 циклов.

Сигнал флуоресценции в ходе амплификации возрастает пропорцианально

количеству продуктов амплификации, что позволяет проследить ход реакции

и судить об исходном количестве ДНК в образцах.

Результаты флуоресценции(«разгорания») зонда фиксируются детектирующим устройством и обрабатываются компьютерной программой и выводятся на

экран в виде обработанных кривых:

 

Флуоресценция положительных образцов усиливается с каждым циклом ампли

фикации, а отрицательных образцов остается на базовом уровне.

По мере расходования компонентов реакции кривая переходит в плато.

В положительных образцах кривая амплификации переходит в плато до 40

цикла.

После 40 цикла – отрицательный образец.

Время амплификации от 1ч 20 мин до 2 ч 20 мин.

Достоинства ПЦР-диагностики:

· Высокая чувствительность метода

· Возможность диагностики на ранних стадиях заболевания

· Исследование различного материала от больных

(плазма/сыворотка крови; соскобы со слизистых оболочек, ликвор, мокрота

моча, эякулят, пунктаты)

· Выявление широкого спектра возбудителей, включаятруднокультивиру-

емые и некультивируемые бактерии, вирусы, простейшие.

Недостатки ПЦР-диагностики:

- Высокая стоимость оборудования

-Одновременная амплификация ДНК как живого, так и погибшего м/о,

элиминация возбудителя не ранее 4-8 недель

-Возможность перекрестной реакции

- Получение ложноотрицательных результатов при наличии ингибиторов ПЦР.

- Определенная техническая подготовка персонала.

- Вероятность контаминации:

А) Перекрестной контаминации от пробы к пробе, возникающая в процессе обработки образцов или при раскапывании реакционной смеси.

Б) Контаминация продуктами амплификации (ампликонами)

 

 

Преимущества ПЦР в реальном времени:

· Амплификация и детекция проходят одновременно в закрытых пробирках, что

снижает риск контаминации образцов.

· Мониторинг и количественный анализ накопления продуктов ПЦР.

Возможность определения геномэквивалентов /мл образца.

· Автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

· Не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования,

, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР-лаборатории.

· Высокая производительность, особенно при использовании автоматического

нуклеовыделения и готовых реакционных смесей (ГРС)

· Высокая чувствительность метода, в 2-3 раза выше детекции методом электрофореза.

· Широкий спектр наборов для данного типа детекции:

- Для диагностики ИППП и дисбиозов урогенитального тракта(Флороценоз)

- Для диагностики ОКИ

-Для диагностики ОРВИ

-Для диагностики клещевых инфекций

-Для диагностики герпесвирусных инфекций

-Для диагностики вирусных инфекций-краснухи, парвовирусной В19 инфекции

- Для диагностики коклюша, респираторного микоплазмоза и хламидофилеза.

- Для диагностики бактериальныхнейроинфекций

- Для диагностики ВПЧ-инфекции

- Для диагностики туберкулеза

-Для диагностики лептоспироза.

 

Генетическое секвенирование- расшифровка всей генетической последовательности

НК.


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2017-05-05; Просмотров: 4660; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.014 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь