Золотой стандарт видовой идентификации микроорганизмов.

Организация ПЦР-лаборатории.

Способность ПЦР нарабатывать ДНК даже с единственной подходящей матричной молекулы накладывает определенные условия на организацию лаборатории.

Если лабораторное оборудование или реактивы будут загрязнены продуктами преды-

дущих реакций, это может привести к получению некорректных результатов в после-

дующих ПЦР-исследованиях с теми же праймерами.

Требования к работе с ПЦР изложены в

МУ 1.3.2569-09 «Организация лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микрорганизмыI-IV групп патогенности»

Должен соблюдаться ряд требований:

1) Организация отдельных помещений для разных этапов ПЦР-анализа:

- Зона разбора и пробоподготовки исследуемого материала

- Зона очистки нуклеиновыых кислот

-Зона проведения амплификации

-Зона учета продуктов амплификации

Для флуоресцентных методик зона амплификации объединена с зоной учета

продуктов ПЦР-анализа.

Для электрофоретического метода учет продуктов амплификации проводится

в отдельном помещении с автономной системой вентиляции.

2) Каждый из указанных выше этапов должен осуществляться отдельным набором

автоматических пипеток и с использованием одноразовых расходных материалов

(наконечников, пипеток).

3) Желательно использовать наконечники и пробирки с маркировкой «DNAseandRNA

se free»

4) Желательно, чтобы наконечники для пипеток были с аэрозольными фильтрами

(aerosol-resistant tips)

5) Каждый из процессов (очистка ДНК, проведение реакций и, если требуется нанесе-

ние образцов в гель после реакции) необходимо выполнять в новых одноразовых

перчатках (без талька)

6) Необходимо избегать перемещения оборудования или реактивов из одного помеще-

ния в другое. (особенно из электрофоретической комнаты в другие комнаты)

7) Желательно проводить этапы приготовления реакций и электрофорез силами разных

сотрудников, а при выполнении всех этапов одним сотрудником, желательно про-

водить гель-электрофорез в конце рабочего дня, чтобы после электрофоретической

комнаты не заходить в комнаты для очистки ДНК и проведения амплификации.

8) Очистку ДНК и приготовление реакций желательно проводить в ПЦР-боксах ( или

в ламинарах с выключенным воздушным потоком, поскольку воздушный поток по-

вышает вероятность кросс-контаминации образцов ) с УФ-лампами, которые небхо

димо включать на ночь.

9) Необходимо включать в экспериментальную постановку контрольные реакции:

- ОКО –отрицательный контрольный образец (не содержит матричную ДНК).

наличие продуктов амплификации в ОКО свидетельствует о загрязнении оборудо-

вания или реактивов продуктами ПЦР предыдущих исследований.

- ПКО – положительный контрольный образец, в котором реакция должна пройти

обязательно.Отсутствие результата в ПКО свидетельствует об ошибках в приготов-

лении реакции или испорченных реактивах.

- ВКО- внутренний контрольный образец, свидетельствует о качестве проведения

этапа очистки (экстракции, выделения) нуклеиновых кислот (ДНК/РНК).

 

Методы выделения ДНК и РНК

Цель экстракции:

-Удаление белков, ДНК или РНК

- Изоляция специфического типа ДНК (или РНК)

Основные требования:

- Низкая трудоемкость

-Быстрота выполнения процедуры

-Максимальное удаление ингибиторов ПЦР

-Минимизация потерь нуклеиновых кислот

- Низкий риск перекрестной контаминации «от образца к образцу»

Способы выделения зависят от вида исследуемого материала, от его природы, характера

и свойств выделяемого объекта.

 

3 этапа:

Разрушение клеток (лизис)

Кипячение, использование хаотропных агентов.

 

Инактивация нуклеаз

Очистка нуклеиновых кислот

Возможна дополнительная обработка ферментами: протеазами, РНК-азами.

Типы методов:

1) По дифференциальной растворимости

2) Адсорбционные методы

3) В градиентной плотности при центрифугировании

Один из популярных методов выделения ДНК основан на использовании для лизиса сильного хаотропного агента – гуанидинатиоцианата и последующей сорбции ДНК

на носителе.

Гуанидинтиоцианат-очень сильный денатурирующий агент, который используется для

одновременного лизиса клеток и денатурации всех клеточных белков (в том числе РНК-аз)

После серии отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она

хорошо снимается с помощью элюирующего буфера.

+: - Удобный и технологичный метод

-: -Потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе и в процессе отмывок.

- Следовые количества гуанидинатиоцианата могут ингибировать амплификацию.

С целью усовершенствования методики:

-Лизис клеток гуанидиномтиоцианатомс последующей сорбцией на частицах двуокиси

кремния.

- Лизис клеток гуанидинтиоцианатом с последующим высаживанием изопропаноломс

последующими отмывками и элюцией.

Следует отметить, что:

РНК более лабильна, чем ДНК, а РНК-азы более устойчивы к денатурации, чем ДНК-азы., что затрудняет получение полноразмерной РНК.

Группа методов, основанная на использовании афинных ионообменников типа Chilex:

Сорбент с низкой емкостью, в отличие от стекла, сорбирует не ДНК, а примеси.

2 стадии:

- Кипячение образца на термошейкере в результате чего клеточные стенки разрушаются или лизис с детергентами, не ингибирующими ПЦР, нуклеиновые кислоты выходят в раствор.

- Сорбция примесей на ионообменнике.

 

Методы выделения нуклеиновых кислот постоянно совершенствуются в сторону уменьше-

ния количества манипуляций и в идеале должны состоять из одной или двух процедур.

 

Эффективность выделения ДНК и особенно РНК повышается, если использовать специаль-

ные приборы-риболайзеры.

 

Преимущества:

-Увеличение производительности

-Сокращение времени

-Снижение риска перекрестной контаминации

-Стандартизация процесса нуклеовыделения

-Снижение вероятности появления ошибок в работе оператора.

Используют колонки (картриджи), заполненные сорбентом ДНК (промывка и элюция ДНК

осуществляется проточным способом или центрифугированием), магнитными сорбентами,

связывающие нуклеиновые кислоты различными способами или связывающие поверхност-ные белки клеточных мембран.

В автоматических системах используют пробирочный и планшетный форматы выделения нуклеиновых кислот.

Ручные операции сведены к загрузке образцов, реактивов и расходных материалов в экстрактор.

24 экстракции за 40-60 мин.

ВКО:

-эндогенный – о качестве забора материала и его сохранности.

-экзогенный –контроль эффективности экстракции и эффективности удаления ингибиторов

ПЦР / ОТ-ПЦР. Данный вид ВКО добавляется на стадии экстракции.

Учитываетя по своему каналу, обычно по каналу FAM

 

Клинический материал содержит широкий спектр ингибиторов амплификации:

- Гемоглобин крови

-Иммуноглобулины

-Слизь (мукополисахариды)

-Ферменты (нуклеазы, протеазы)

-Билирубин и желчные кислоты

-Мочевина

-Гормоны

-Ионы металлов

-Продукты жизнедеятельности сопутствующей микрофлоры

- Гепарин

Оборудование.

Термоциклеры-приборы, способные циклически изменять температуру и время на основе

специальной заданной программы.

Амплификаторы отличаются друг от друга системами охлаждения, способами обогрева,

режимами регулирования смены температуры, количеством платформ.

В термоциклере пробирки помещаются в металлический блок, температура которого изме-

няется с помощью элемента Пелтье, который позволяет изменять температуру блока с боль-

шой скоростью, что сокращает продолжительность каждого цикла ПЦР.

Современныетермоциклеры приспособлены к использованию тонкостенных пластиковых

пробирок для реакционной смеси, что позволяет ускорить теплообмен между блоком прибора и реакционной смесью и дополнительно сократить время проведения реакции.

 

Регулирование по матрице, при котором заданный в программе температурный профиль

трактуется как температурный профиль термоблока.

Схема амплификации

 

Схема амплификации

⇐ Предыдущая123

Поделиться: