Методы диагностики наследственных болезней

1) Методы цитогенетического исследования можно условно

подразделить на прямые и непрямые.

Прямые методы - это методы получения препаратов делящихся клеток без культивирования.

Непрямые методы – это получение препаратов хромосом из клеток, культивированных в искусственных питательных средах.

Прямые методы позволяют проводить хромосомный анализ клеток опухолей, но в основном используются для изучения костного мозга. Костный мозг получают при стернальной пункции, помещают его в питательную среду, добавляют колхицин (он останавливает деление клеток на стадии метафазы), инкубируют клетки около 2-3 ч при 37°С, а затем готовят препараты хромосом.

Непрямые методы связаны с культивированием клеток. Наиболее удобный объект для исследования – культура лейкоцитов периферической крови. Для ее получения достаточно взять 1-2 мл венозной крови, добавить гепарин и поместить в смесь питательной среду с фитогемагглютинином (белок бобовых растений), для стимуляции деления клеток. Продолжительность культивирования 48-72 часа. За 2 ч до окончания культивирования добавляют колхицин, разрушающий веретено деления и останавливающий клеточное деление на стадии метафазы.

Затем, для получения хороших метафазных пластинок проводят гипотонизацию клеток. Обычно для этого используют гипотонический раствор хлорида кальция или цитрата натрия. В гипотоническом растворе клетки набухают, ядерная оболочка разрывается, межхромосомные связи рвутся и хромосомы свободно плавают в цитоплазме, на некотором расстоянии друг от друга (метафазные пластинки). Клеточную суспензию фиксируют смесью метанола и уксусной кислоты в соотношении 3: 1.При нанесении такой суспензии на предметное стекло фиксатор испаряется, и хромосомы плотно прилипают к стеклу.

Для точного изучения хромосом, делают фотографии, затем вырезают хромосомы и располагают их в порядке убывающей величины, так строят кариограмму или идиограмму.

Для идентификации хромосом применяют количественный морфометрический анализ, измеряют длину хромосомы в микрометрах, соотношение длины короткого и длинного плеча ко всей хромосоме, то есть находят центромерный индекс (ЦИ).

Следующая стадия цитогенетических методов это окраска препаратов.

Простые методы окраски – окраска по Гимзе («рутинная окраска»). Краситель Гимзы окрашивает все хромосомы равномерно по всей длине, при этом выделяются центромеры и вторичные перетяжки (если хромосома имеет спутник). Этот метод позволяет провести подсчет хромосом и их групповую принадлежность, проанализировать повреждения хромосом (хромосомные аберрации). Однако этот метод не дает возможности индивидуальной идентификации хромосом.

Дифференциальные методы окраски хромосом дают достаточно полное представление о кариотипе и используются для определения структурных хромосомных аномалий (делеции, транслокации, инверсии).

Под дифференциальной окрашиваемостью хромосом понимают их способность к избирательному окрашиванию по длине. Окрашивание хромосом обеспечивается температурно-солевыми воздействиями на фиксированные хромосомы. При этом выявляется структурная дифференцировка хромосом по длине, выражающаяся в виде чередования гетеро- и эухроматина (темные и светлые участки). Протяженность этих участков специфична для каждой хромосомы, соответствующего плеча и района.

При этом окрашивании идентифицируются все хромосомы, плечи и определенные районы хромосом. На практике наибольшее применение получили методы дифференциальной окраски красителем Гимза (G – окраска) и флуоресцирующим красителем акрихином и акрихин-пиритом(Q –метод).Методы дифференциального окрашивания пригодны для анализа хромосом, полученных из культур клеток любых тканей.

Новым методом изучения хромосом являются высокоразрешающие методы– молекулярно-цитогенетический метод гибридизации гибридизации in situ, в частности флуоресцентная гибридизация in situ(FISH-метод). Принцип этого метода состоит в следующем:

- Сначала готовится однонитевой участок ДНК к которому присоединяется биотин и дигоксигенин. Такой «помеченный» участок ДНК называется зондом.

- При щелочной обработке между двумя нитями ДНК разрываются связи (денатурация).

- Затем зондом обрабатывают препарат. Поскольку последовательность оснований ДНК зонда и соответствующий участок хромосомы взаимно комплементарны, то зонд присоединяется к хромосоме. В этом участке происходит ренатурация ДНК.

- После этого препарат обрабатывают веществом, которое благодаря своей структуре способно избирательно присоединяться к биотину или дигоксигенину (для биотина – стрептовидин, для дигоксигенина – антидигоксигениновое антитело). К этим веществам могутбыть присоединены флюоресцентные красители (родамин – красный цвет или флюоресцеинизотиоцианат – зеленый цвет).

- С помощью люминесцентного микроскопа окрашенные хромосомы визуализируются на фоне неокрашенных.

Границы применения методаFISH-метода широкие: от локализации гена до расшифровки сложных перестроек между несколькими хромосомами.

2) Биохимические методы в отличие от цитогенетических

многоступенчаты. Для их проведения требуется аппаратура разных классов. Объектами биохимической диагностики могут быть моча, пот, плазма и сыворотка крови, форменные элементы крови, культура клеток (фибробласты, лимфоциты).

Различают два вида программ первичной биохимической диагностики: массовые и селективные.

Существуют массовые просеивающие программы диагностики среди новорожденных фенилкетонурии, врожденного гипотиреоза, адреногенитального синдрома, галактоземии и муковисцидоза.

Биологическим материалом для диагностики является кровь. Высушенные капли крови новорожденных на хромотографической или фильтровальной бумаге пересылают из родильных домов в специализированную лабораторию. Материал должен поступить в лабораторию в течение двух-трех дней после взятия пробы.

Селективные диагностические программы в отличие от программ массового обследования новорожденных предусматривают целенаправленное обследование меньших по объему категорий детей, отстающих в психомоторном развитии, имеющих недифференцированные патологические состояния, а также детей с повышенным риском по ряду заболеваний. В селективных программах могут использоваться простые качественные реакции (например, тест с хлоридом железа для выявления фенилкетонурии) или более точные методы, позволяющие обнаруживать большие группы отклонений.

Показаниями для селективного скрининга у новорожденных являются такие симптомы, как судороги, кома, рвота, гипотония, желтуха, специфический запах мочи и пота, ацидоз, нарушенное кислотно-основное равновесие, остановка роста. У детей биохимические методы используются во всех случаях подозрения на наследственные болезни обмена веществ (задержка физического и умственного развития, потеря приобретенных функций, специфическая для какой-либо наследственной болезни клиническая картина).

3) Молекулярно-генетические методы – это большая и разнообразная

группа методов, предназначенных для выявления вариаций в структуре исследуемого участка ДНК. В основе этих методов лежат «манипуляции» с ДНК и РНК.

1. Получение образцов ДНК (или РНК):

а) выделение всей ДНК (тотальной или геномной) из клеток;

б) накопление определенных фрагментов, которые предполагается анализировать с помощью полимеразной цепной реакции.

Источником геномной ДНК могут быть любые ядросодержащие клетки. Выделенная из клеток ДНК представляет собой весь геном организма. На практике чаще используют периферическую кровь (лейкоциты), хорион, амниотические клетки, культуры фибробластов. Для одного анализа достаточно небольшого количества биологического материала: например, 20-40 мг хориона, 1 мл крови, 5-10 мг культуры клеток. Для осуществления некоторых методов достаточно иметь 1 каплю крови или соскоб эпителия со щеки, или несколько волосяных луковиц.

В большинстве случаев для успешной диагностики болезни или гетерозиготного состояния достаточно исследовать лишь небольшой фрагмент генома. Для проведения анализа необходимо получить достаточное количество таких фрагментов, т.е амплифицировать (умножить) их. Эту задача – накопление нужных фрагментов ДНК – решается с помощью полимеразной цепной реакции.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – это метод амплификации

ДНК в условиях in vitro. В основе метода лежит многоцикловой процесс, напоминающий естественную репликацию нуклеиновой кислоты, причем каждый цикл состоит из трех последовательных этапов.

Первый этап– денатурация искомой нуклеиновой кислоты температурой до 70-80°С, после чего нуклеиновая кислота присутствует в растворе в виде отдельных цепей. Если искомой нуклеиновой кислотой является РНК, то она предварительно переводится в ДНК методом обратной транскрипции.

На втором этапе к определенному участку каждой из противоположных цепей присоединяются праймеры – короткие олигонуклеотиды, комплементарные известным нуклеотидным последовательностям. Для осуществления этого присоединения температура среды понижается до 37-40°С.

На завершающем третьем этапе происходит синтез новых цепей (амплификация нуклеиновой кислоты) при участии фермента – термостабильной ДНК полимеразы, поскольку этот этап, как и первый протекает при высокой температуре.

2. Рестрикция ДНК на фрагменты. Этот процесс осуществляется

Ферментами рестриктазами, относящимися к группе эндонуклеаз. Основное их свойство – разрывать двуцепочечную ДНК в пределах строго определенных для каждого фрагмента последовательностях нуклеотидов протяженностью 4-6 пар оснований. При обработке ДНК рестриктазой получается закономерный для данного фермента набор фрагментов различной длины.

3. Электофорез фрагментов ДНК обеспечивает разделение этих

фрагментов при их распределении на поверхности агарозного или полиакриламидного геля. Фрагменты ДНК движутся в геле, помещенном в постоянное электрическое поле, от отрицательного полюса к положительному в зависимости от размеров (чем больше относительная молекулярная масса фрагмента, тем медленнее он движется в электрическом поле).

После окончания электрофореза каждый фрагмент ДНК занимает определенное положение в виде дискретной полосы в конкретном месте геля. Длину каждого фрагмента можно определить путем сравнения пройденного фрагментом расстояния с расстоянием, пройденным стандартным образцом ДНК с известными размерами.

4. Визуализация и идентификация фрагментов ДНК в геле является

либо конечным этапом диагностики, либо необходимым элементом дальнейшего анализа. Визуализация фрагментов ДНК после ПЦР осуществляется сравнительно легко.

После окончания ПЦР проводится электрофорез в агарозном геле, после чего гель обрабатывается этидия бромидом, который связывается с ДНК. При УФ-облучении поверхности геля выявляется свечение в красной области спектра.

Идентификация конкретных фрагментов в геле среди геномной ДНК является более сложной задачей. Из-за больших размеров генома человека после рестрикции образуется настолько большое число рестриктных фрагментов, что агарозный гель после электрофореза и окраски этидия бромидом приУФ-облучении выглядит как более иди менее равномерно окрашенная поверхность.

Выявить специфические фрагменты ДНК позволяет блот-гибридизация по Саузерну. Эта методика включает:

- Денатурацию ДНК с помощью оснований. После окончания электрофореза гель помещают в раствор основания (щелочи), в котором двуцепочечные фрагменты ДНК теряют связи и становятся одноцепочечными.

- Перенос ДНК с геля на нитроцеллюлозный или нейлоновый фильтр в буферном растворе. Непосредственно на поверхность геля кладут фильтр и стопку фильтровальной бумаги. За счет капиллярного эффекта создается ток буфера, перпендикулярный плоскости геля. Вымываемая из геля ДНК задерживается фильтром и практически полностью оказывается на поверхности.

После переноса одноцепочечные нити фиксируют на фильтре. Расположение фрагментов на фильтре точно соответствует их расположению в геле.

Сегодня молекулярно-генетические методы используют при диагностике многих наследственных болезней: гемофилии, гемоглобинопатиях, митохондриальных болезней, муковисцидозе, фенилкетонурии, миопатии Дюшенна и др.

Кроме того, методы ДНК-технологии применяются: в исследованиях для определения происхождения популяции людей, в практике судебной медицины, для определения отцовства или степени родства, для генетического анализа клеток костного мозга при его трансплантации от донора реципиенту, для определения мутаций, при диагностике наследственных болезней и для расшифровки генома человека.

⇐ Предыдущая567891011121314Следующая ⇒

Поделиться: