Архитектура Аудит Военная наука Иностранные языки Медицина Металлургия Метрология
Образование Политология Производство Психология Стандартизация Технологии


Допинг-контроль: методы и тесты



Содержание

[убрать]

· 1 Исторические аспекты анализа низкомолекулярных веществ в допинг-контроле

· 2 Классификация стимулирующих препаратов

o 2.1 Запрещенные субстанции

· 3 Методы анализа

o 3.1 Газовая хроматография

o 3.2 Жидкостная хроматография

o 3.3 Детекторы

· 4 Способы ионизации

· 5 Масс-анализаторы

· 6 Очистка и приготовление образцов

o 6.1 Жидкостная экстракция

o 6.2 Твердофазная экстракция

o 6.3 Иммуноаффинная хроматография

o 6.4 Метод дериватизации

· 7 Читайте также

· 8 Литература

Исторические аспекты анализа низкомолекулярных веществ в допинг-контроле

Желание искусственным путем увеличить свою силу, способности и выносливость возникло одновременно с появлением первых спортивных соревнований. Уже в сочинениях Филострата и Галена имеются упоминания о попытках атлетов на античных Олимпийских играх увеличить свою силу и выносливость с помощью отваров из грибов и семян растений, а также специальных диет, в частности, предусматривавших употребление в пищу яичек быка (Burstin, 1963; Prokop, 1970, 2002). Более того, спортсмены Древнего Рима проделывали аналогичные манипуляции с животными — они поили своих скаковых лошадей гидромелем — напитком из меда, смешанного с водой, пытаясь таким образом увеличить их силу (Morgan, 1957; Aliens, 1965). Считают, что основной причиной подобного поведения спортсменов, пытавшихся искусственным способом получить решающее преимущество в соревнованиях, были известность, слава и почет, а также денежные награды, которые стали еще более существенными факторами после возникновения профессионального спорта, конных скачек и собачьих бегов. В начале XX столетия русские и австрийские ученые разработали первые экспериментальные методы определения стимуляторов в слюне лошадей, и в 1910—1911 гг. около 220 образцов были подвергнуты анализу с целью обнаружения алкалоидов, применявшихся в качестве допинга. В период между 1938 и 1954 гт. были предложены принципиальные процедуры обнаружения таких стимуляторов, как амфетамины, однако они характеризовались ограниченной чувствительностью и результаты анализа в значительной степени зависели от посторонних активных веществ, присутствующих в биологических образцах (Richter, 1938; Keller, Ellenbogen, 1952; Axelrod, 1954). Однако уже в 1956 г. был предложен получивший широкое распространение метод, основанный на жидкостной экстракции с последующей хроматографией на бумаге и визуализацией результатов разделения (Vidic, 1956). Фатальность применения допинга стала очевидной в 1886 г., когда во время велогонки Париж —Бордо от передозировки кофеина умер велогонщик Линтон (Prokop, 2002). В последующие 70 лет были зафиксированы многочисленные смертные случаи, связанные с применением стимуляторов, в основном среди велогонщиков. Приводим несколько случаев, зарегистрированных только в Италии (Vcnerando, 1963): смерть велогонщика в результате отравления амфетамином (1949); госпитализация велогонщика с тяжелым отравлением чрезмерной дозой амфетамина (1956); велосипедист в состоянии шока, вызванного большой дозой симпатомиметиков (1958); госпитализация велосипедиста с интоксикацией амфетамином и аналептиками (1962). Формирование допинговых комиссий во Франции (1959), Австрии (1962) и Италии (1963), а затем и Медицинской подкомиссии Международного олимпийского комитета (МОК) в 1967 г., положили начало крупномасштабной борьбе против допинга. Первый официальный допинг-контроль был осуществлен во время Олимпийских игр в Гренобле (1968), где впервые для скрининга лиц, применявших стимуляторы, проведен первый анализ (Beckett et al., 1967). В последующие десятилетия список запрещенных препаратов и методов стимуляции многократно изменялся и дополнялся. Было разработано большое количество методов, предназначенных для определения веществ, применяемых в качестве допинга, продуктов их обмена и их влияния на физиологические и биохимические показатели организма.

Классификация стимулирующих препаратов

Запрещенные субстанции

Учитывая большое разнообразие запрещенных веществ, не существует списка, в котором все они были бы перечислены. Примеры для каждой группы дополнены фразой "... и аналогичные вещества", результатом чего является запрет на использование всех соединений, близких по фармакологическим или физико-химическим свойствам. Ниже представлена классификация запрещенных субстанций и методов воздействия, предложенная МОК и Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА) (International Olympic Committee, 2003). Для некоторых лекарственных препаратов и веществ, таких, как β -блокаторы, кортикостероиды, местные анестетики, алкоголь, запрет на применение ограничивается отдельными видами спорта с учетом медицинских показаний.

Классификация запрещенных субстанций и методов воздействия, предложенная Международным олимпийским комитетом (МОК) и Всемирным антидопинговым агентством (ВАДА)

· Запрещенные классы веществ

· Стимуляторы

· Наркотические вещества

· Анаболические препараты

· Диуретики

· Пептидные гормоны, миметики и их аналоги

· Препараты с антиэстрогенной активностью

· Маскирующие препараты

· Запрещенные методы воздействия

· Стимуляция транспорта кислорода

· Фармакологические, химические и физические манипуляции

· Генный допинг

· Классы субстанций, запрещенных в отдельных видах спорта

· Алкоголь

· Каннабиноиды

· Местные анестетики

· Глюкокортикостероиды

· β -блокаторы

СТИМУЛЯТОРЫ

Стимуляторы представляют собой, вероятно, наиболее древний вид субстанций, используемых человеком в качестве допинга. Сюда относятся такие соединения, как амфетамин, эфедрин, кофеин. Последний применяли уже мексиканские инки в XVI ст., потреблявшие листья коки, чтобы преодолеть расстояние более 1000 миль (1609 км) между Куско и Кито за 5 дней (www.g-o.de, 2003), а первое допинговое вещество, обнаруженное в образцах мочи спортсменов в XX ст., относилось к амфетаминам. Поскольку эфедрин входит в состав ряда противопростудпых препаратов, а кофеин содержится во многих холодных и горячих напитках, была установлена граница предельного содержания этих веществ в моче, что требует проведения количественной оценки их содержания в моче. Новые правила, вступившие в силу с января 2004 г., полностью сняли запрет на использование кофеина.

Одним из спорных веществ, запрещенных WADA является ноотропный препарат фенотропил.

АНАБОЛИЧЕСКИЕ ПРЕПАРАТЫ

Применение стимуляторов и наркотиков представляет интерес преимущественно во время соревнований, тогда как анаболические препараты являются эффективным средством воздействия в период проведения тренировочных занятий. Вещества, стимулирующие рост мышечной ткани и увеличение силовых показателей, были внесены в список запрещенных субстанций МОК в 1976 г., а после 1993 г. в класс анаболических препаратов были включены не только стероиды — производные тестостерона, но и β 2-агонисты, поскольку они также вызывают анаболический эффект при использовании в дозах, существенно превышающих терапевтические (Reedset al., 1998; Wagner, 1989; Stallion et al., 1991; Hoher, TroidI, 1995).

ДИУРЕТИКИ

Диуретики рассматриваются в качестве допинговых препаратов на основании следующих фактов: а) спортсмены, соревнующиеся в видах спорта, где происходит разделение на весовые категории, могут снижать массу тела искусственно стимулированным диурезом, т. е. увеличением выделения мочи; б) увеличение водных потерь приводит к разбавлению мочи и снижению концентрации выделяемых веществ. Таким образом, диуретики могут маскировать применение запрещенных субстанций, для которых установлен количественный порог содержания в моче. Класс диуретиков, в частности, может служить демонстрацией физико-химической гетерогенности одной группы препаратов. На основании химической структуры, места и механизма воздействия диуретические препараты могут быть разделены, но меньшей мере, на 6 групп. Это так называемые тиазиды (например, гидрохлортиазиды), производные сульфамоилбензойной кислоты (например, фуросемид), осмотические диуретики (например, маннитол), ингибиторы карбоангидразы (например, ацетазоламид), производные феноксиуксусной кислоты (например, этакриновая кислота) и калийсберегающие диуретики (например, спиронолактон).

БЕТА-БЛОКАТОРЫ

Препараты, блокирующие β -адренорецепторы (также называемые β -блокаторы), запрещены для применения в таких видах спорта, как стрельба и прыжки на лыжах из-за их седативного эффекта. В общем структурная формула β -блокаторов включает фенольное кольцо с оксипропаноламиновой боковой цепью, которая заканчивается изопропиловым или третбутиловым остатком (как в случае иропранолола и левобунолола), либо фенилэтаноламиноиое ядро с заменами боковых атомов водорода, например на нитритный остаток (нифеналол). Современные β -блокаторы могут иметь и несколько иную структуру, как например лекарственный препарат небиволол. Начиная с 1988 г. этот класс препаратов был включен МОК в список запрещенных к применению субстанций.

В списке запрещенных субстанций, приведенном выше, есть и другие классы запрещенных веществ, таких, как пептидные гормоны, однако здесь мы будем рассматривать только низкомолекулярные химические соединения.

Методы анализа

Первые получившие широкое распространение методики скрининга и доказательств для допинг-контроля заключались в приготовлении препаратов проб с использованием жидкостной экстракции мочи, концентрации полученных экстрактов и разделении анализируемых веществ с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ). Для анализа продуктов, разделенных с помощью ГЖХ, использовали плазменно-ионизационный детектор (ПИД), который позволял обнаружить присутствие стимуляторов из группы амфетамина по сигналу с временем удержания, сопоставимым со стандартными образцами аналогичных препаратов. Тонкослойную хроматографию применяли для идентификации стрихнина и таких стимуляторов с гидроксилированным кольцом, как β -гидроксиамфетамин и фенилэфрин (Beckett et al., 1967). В случае позитивных результатов теста дополнительную информацию об анализируемых веществах получали с помощью дериватизации, микроинфракрасной спектроскопии, а также масс-спектрометрии (МС). Совершенствование аналитических методов и появление различных технических новшеств привело к разработке сложных процедур приготовления образцов и появлению разнообразных видов анализа, и наконец, к созданию и выпуску в продажу специального оборудования, что в целом позволяет проводить обширный анализ образцов мочи элитных спортсменов с целью допинг-контроля. В зависимости от свойств анализируемых веществ применяются различные аналитические инструменты. Принципы работы некоторых из них рассмотрим ниже.

В целом предварительное хроматографическое разделение экстрактов, полученных из биологических материалов, таких, как кровь, моча или волосы является в большей или меньшей степени обязательным условием для последующего аналитического анализа. Это позволяет получить более подробную информацию об анализируемых образцах; например, разница во времени удержания позволяет разделить стереоизомеры, кроме того, так можно отделить вещества, представленные в образце в небольших концентрациях, от тех которые составляют его значительную часть. Современные хроматографические системы основаны на применении капиллярной газовой хроматографии или высокоэффективной жидкостной хроматографии, оба эти метода чрезвычайно сложны и развились в отдельные разделы аналитической химии.

Газовая хроматография

Сегодня капиллярные колонки представляют собой наиболее распространенное средство для проведения газовой хроматографии (ГХ) с целью допинг-контроля. Их высокая эффективность с точки зрения качества разделения, износоустойчивость и необыкновенное разнообразие неподвижных фаз обеспечивает широкий выбор для создания различных методик и возможности для решения таких задач, как проведение полного анализа или скрининг специфических веществ. Колонка состоит из трех основных элементов: (а) внешнего защитного покрытия; (б) слоя сорбента из плавленого кварца и (в) неподвижной фазы.

Кварцевое покрытие. Сорбирующий слой изготовлен из синтетического кварцеподобного стекла высокой степени чистоты с низким содержанием примесей оксидов металлов. Такое покрытие благодаря наличию групп силанола имеет чрезвычайно активную поверхность, которая может реагировать с полярными группами анализируемых веществ, такими, как гидроксильные, карбоксильные и тиольные остатки, а также первичными и вторичными аминами, что приводит к появлению " хвостов" у пиков разделяемых веществ и снижению интенсивности пиков. Поэтому при подготовке колонки производится деактивация силанольных групп с помощью подходящей химической обработки, например путем триметилсилилирования. Полученное таким образом покрытие хорошо подходит для нанесения неподвижной фазы.

Неподвижная фаза. Неподвижная фаза в газовой хроматографии играет основную роль, поскольку именно она определяет время удержания, качество разделения и форму пиков анализируемых веществ. Эта особая часть капиллярной колонки состоит либо из полисилоксанов/силиконов, полиэтиленгликолей (ПЭГ) либо из пористого слоя сорбента. Чаще всего в качестве неподвижной фазы используют замещенные полисилоксаны, которые обладают высокой стойкостью и сроком службы. Общая химическая структура неподвижных фаз изображена на основе полисилоксанов, которые представляют собой цепочку из чередующихся кислорода и кремния с боковыми замещающими группами, присоединяющимися по две к каждому атому кремния. Структура и количество замещающих групп являются характеристикой каждой неподвижной фазы. Используют преимущественно четыре замещающие группы в разном соотношении: а) метальные; б) фенильные; в) цианопропильные, г) трифторпропильиыс остатки. Выбор замещающих групп и их относительная представленность в неподвижной фазе определяют полярность ГХ колонки. Еще одним материалом, применяемым для формирования неподвижной фазы в ГХ-колонках, является ПЭГ, основной характеристикой которого является молекулярный вес или длина цепей полимера. Существенное отличие этого материала от полисилоксана заключается в возможности создания неподвижных фаз с определенным значением pH, т. е. кислотных или щелочных колонок, которые демонстрируют лучшие показатели при разделении кислотных или щелочных соединений соответственно. Основным недостатком является высокая чувствительность к кислороду, особенно при повышенных температурах, которая приводит к разрушению неподвижной фазы и сокращает срок службы колонки. Неподвижные фазы для адсорбционной хроматографии состоят из мельчайших частичек пористых материалов (например, полимеров, оксида алюминия, молекулярных сит), которые присоединяют к кварцевому покрытию капилляра с помощью химических линкеров. Благодаря высокой адсорбирующей способности в отношении газообразных веществ такие неподвижные фазы используют преимущественно для хроматографии наиболее летучих компонентов или газов, которые обычно плохо связываются с неподвижными фазами на основе полисилоксанов или ПЭГов, поэтому температуры разделения здесь не превышают 35 ’С. В случае применения так называемых капиллярных ГХ колонок PLOT (porous layer open tubular) твердофазная абсорбция газов является основным механизмом разделения, обеспечивающим эффективное удержание летучих веществ. В то же время сильная адсорбция анализируемого вещества на неподвижной фазе не позволяет использовать такие колонки для деления менее летучих веществ.

Внешняя оболочка. Поскольку капилляры из сплавленного кварца очень хрупкие, для них требуется защитное внешнее покрытие. Для этой цели обычно используют полиимид, который обладает двумя достоинствами: во-первых, колонки с полиимидной оболочкой достаточно прочные и не требуют деликатного обращения, во-вторых, полиимид покрывает и заполняет все трещины в капиллярах из сплавленного кварца, предотвращая увеличение дефектов.

После рассмотрения устройства капиллярной колонки для газовой хроматографии следует отметить еще два параметра, оказывающих заметное влияние на качество хроматографического разделения: размеры колонки, т. е. длина, диаметр и толщина пленки неподвижной фазы, а также газы-носители.

Тогда как длина и диаметр колонки влияют в основном на разрешение пиков, толщина пленки неподвижной фазы определяет емкость колонки и удержание анализируемых веществ. Длина колонки прямо пропорциональна количеству теоретических тарелок, а поскольку разрешение пропорционально корню квадратному количества теоретических тарелок, разрешение также будет пропорционально корню квадратному длины колонки. Иными словами, удвоение длины колонки (а значит, и количества теоретических тарелок) будет приводить к улучшению разрешения не на 100 %, а только на 25—35 %; уменьшение длины колонки на 50 % приведет к ухудшению разделения примерно на 15 — 25 %. Кроме того, количество теоретических тарелок обратно пропорционально диаметру колонки, следовательно, уменьшение диаметра колонки будет увеличивать эффективность газовой хроматографии, т. е., поскольку разрешение пропорционально квадратному корню из количества теоретических тарелок, уменьшение диаметра колонки в два раза также позволит улучшить разделение на 25—35 %, как, например, при замене колонки с внутренним диаметром 0, 2 мм2 на колонку с диаметром 0, 11 мм2. Емкость колонки непосредственно определяется толщиной пленки неподвижной фазы. Если толщина слоя неподвижной фазы 0, 1—0, 2 мкм подходит для анализа 20—50 нг вещества, то для анализа количеств больше 125 нг необходима колонка с толщиной неподвижной фазы 0, 5 мкм, поэтому толщина пленки должна быть подобрана в соответствии с предполагаемым количеством анализируемых веществ, наносимых на ГХ колонку.

Кроме того, на параметры хроматографического разделения влияет также используемый в качестве носителя газ, эта зависимость описывается кривой Ван Деемтера. В качестве газов-носителей часто используют гелий и водород, причем последний обеспечивает превосходную оптимальную линейную скорость, в результате чего значительно улучшается качество разделения. Явный недостаток водорода щ его высокая воспламеняемость.

Жидкостная хроматография

По сравнению с газовой, принадлежности для жидкостной хроматографии отличаются значительным разнообразием размеров, наполнителей и, поскольку разделение происходит при переносе в жидком носителе, большим набором органических растворителей и буферов. Помимо того, в жидкостной хроматографии (ЖХ) в зависимости от свойств анализируемых веществ могут применяться несколько различных механизмов разделения (нормально-фазовая, обращенно-фазовая, ионообменная и ситовая). В этом кратком обзоре мы коснемся только обращенно-фазовой хроматографии (ОФХ ), которая чаще всего используется при проведении анализов с целью допинг-контроля.

Картриджи. Для использования в ЖХ предлагаются картриджи-колонки различного диаметра. После усовершенствования материалов-наполните-лей (т.е. неподвижной фазы, см. ниже) в лабораториях допинг-контроля для анализа низкомолекулярных соединений чаще всего используют колонки длиной 30—120 мм с внутренним диаметром 1, 0— 4, 6 мм, тогда как в прежние времена для высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) применялись гораздо более объемные и длинные колонки. Уменьшение длины колонок стало возможным после появления обладающих высокой специфичностью высокоизбирательных масс-анализаторов, которые позволяют осуществлять разделение веществ на основании их масс-спегара, благодаря чему потребность в оптимальном хроматографическом разделении анализируемых веществ стала не столь актуальной. Кроме того, была существенно повышена производительность колонок для ЖХ, и это значительно сократило время, необходимое для разделения пиков.

Неподвижная фаза. Как отмечалось выше, определяющим фактором в хроматографии являются параметры неподвижной фазы и жидкостная хроматография в этом не исключение. Здесь необходимо учитывать различные характеристики, в частности размер частиц (3—50 мкм), особенности носителя (частицы силикагеля сферической или неправильной формы), наличие химически связанной фазы (например, С4, С8, С18) и размер пор (50—4000 А).

Для оценки характеристики эффективности хроматографической колонки часто используют пара-метр " количество тарелок п" или " высоту тарелки h". Уравнение Ван Деемтера в его простейшем виде описывает обратную взаимосвязь размера частиц и высоты тарелки; это означает, что уменьшение размера частиц ведет к улучшению эффективности хроматографии, а именно разрешения (Yamashita, Fenn, 1984а; Engelhardt et al., 1985). Поэтому существует тенденция к уменьшению размера частиц наряду с использованием очень коротких колонок в высокоскоростной хроматографии для обеспечения требуемого разрешения пиков.

Чаще всего в качестве материала для приготовления неподвижной фазы обратно фазовой хроматографии используется силикагель. Представленные в продаже виды силикагеля отличаются по своим физическим характеристикам, таким, как площадь специфической поверхности, средний диаметр пор, специфический объем пор и форма. Предполагая, что частицы имеют открытые поры цилиндрической формы, можно выразить взаимосвязь между первыми упомянутыми переменными следующим уравнением:

0 = 103 х 4 Vр /Оsp,

где 0 — средний диаметр пор, нм; Vp — специфический объем пор, млт" 1; Оsp — специфическая площадь поверхности, м2т~' (Scott, 1982). При средней площади поверхности, равной около 300 м2т~', и диаметре пор 10 им специфический объем пор будет составлять примерно 1 млт" 1. В настоящее время как носитель для создания неподвижной фазы в обращенно-фазовой ЖХ в большинстве случаев используют сферические частицы силикагеля, поскольку с помощью его можно достичь более высокой плотности упаковки по сравнению с частицами неправильной формы, полученными при полимеризации кремниевой кислоты. На поверхности такие частицы несут гидроксильные группы (силанольные остатки), которые могут быть использованы для создания химически привитой фазы; она и будет определять свойства колонки для ВЭЖХ. В продаже представлен широкий выбор разнообразных фаз, позволяющий решать самые различные задачи хроматографического разделения, например, часто используют фазы с привитыми феи ильными С18-, С8- и С4-группами, либо более полярные материалы, такие, как фазы с привитыми циано-, амино- и диольными группами. Более того, созданы еше более сложные системы, позволяющие разделять молекулы-стерсоизомеры одного соединения. Самых последних результатов в области высокопроизводительного хроматографического анализа удалось добиться благодаря созданию так называемой монолитной колонны, представляющей собой единый кусок органического полимера или диоксида кремния со сквозными порами в нем, полученный прямой полимеризацией соответствующих мономеров. Такой материал отличается более высокой стабильностью и, что важно, более высокой производительностью по сравнению с обычными колонками, заполненными отдельными частицами.

Подвижная фаза. В случае ОФГ неподвижная фаза является неполярным, а подвижная — полярным компонентом. Обычно в ОФГ применяют буферные системы, состоящие, например, из KH2PO4/H3PO4 или NaH2РО4 в сочетании с такими органическими растворителями, как метанол или ацетонитрил, которые хорошо подходят для анализа с помощью ультрафиолетовых (УФ) детекторов. В то же время применение ВЭЖХ в сочетании с МС предъявляет более серьезные требования к характеристикам элюэнтов, поскольку в отношении ЖХ существуют ограничения на допустимый диапазон pH, выбор растворителя, содержание добавок в растворителе и скорость подачи элюзита, направленные на достижение оптимальных результатов масс-спектрометрии (Wheeler, 1955). Обычно в случае ионизации при атмосферном давлении (например, злектрораспылением) требуется добавление легколетучих растворителем для предотвращения примесей ионов анализируемого вещества, поэтому часто применяемые фосфатные, боратные или сульфатные добавки здесь не подходят, вместо них используют ацетат аммония, формиат аммония или тетраэтиламмониумгидроксид. Более того, при использовании ионизации электрораспыленном не допускаются ингредиенты, которые дают сильные ионные пары, в результате чего после десорбции происходит нейтрализация ионов. Первостепенное значение имеет поддержание pH, особенно в случае ионизации электрораспылепием, поскольку этот параметр усиливает ионизацию анализируемого вещества. Анализ соединений, имеющих щелочную природу, следует производить при кислом pH, применяя такие добавки, как уксусная или муравьиная кислота в концентрации 0, 1 —1, 0 X. в то время как соединения с кислотными свойствами (например, карбоновые кислоты) легче ионизируются в щелочной среде, которую можно создать, например, добавлением гидроксида аммония. В числе часто используемых органических растворителей те же, что применяются и при обычной ВЭЖХ без МС. т. с. метанол, этанол и ацетонитрил.

Детекторы

Детекция и идентификация разделенных хроматографией веществ в допинг-контроле имеет чрезвычайно важное значение. К настоящему времени разработано множество различных систем детекции, в частности пламенно-ионизационный детектор (ПИД), азотно-фосфорный детектор (АФД), УФ фотометрический детектор, а также масс-спектрометрические детекторы, такие, как квадрупольные, времяпролетные, ионные ловушки, масс-анализаторы ионно-циклотронного резонанса с Фурье-преобразо-ванием, тройные квадрупольныс детекторы, магнитные секторные анализаторы. Кроме того, в продаже имеются приборы, включающие два и более различных типов детектирующих устройств, а также разработаны различные прикладные системы для определения применения запрещенных веществ, которые базируются на использовании специальных методик приготовления образцов в сочетании с хроматографией и детектором, обладающих хорошей чувствительностью и избирательностью.


Поделиться:



Последнее изменение этой страницы: 2017-05-05; Просмотров: 515; Нарушение авторского права страницы


lektsia.com 2007 - 2024 год. Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав! (0.024 с.)
Главная | Случайная страница | Обратная связь