ГЛАВА 1. ОСНОВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

ГЛАВА 2. ОШИБКИ И ТРУДНОСТИ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ АНАЛИЗА

 

Простой на первый взгляд метод имеет ряд “подводных камней”, с которыми так или иначе приходится сталкиваться практически каждому специалисту лаборатории. К различным ошибкам могут приводить как отсутствие опыта в использовании данной методики, так и стереотипы мышления персонала, ранее работавшего в биохимических или бактериологических лабораториях, где иные требования к работе. В результате таких ошибок могут быть получены ложноположительные, ложноотрицательные или недостоверные результаты анализов.

С точки зрения получения ложноотрицательного или ложноположительного результата особенно опасны ошибки, контроль которых невозможно осуществить во время проведения ПЦР-анализа, – прежде всего, связанные с нарушением правил взятия, хранения и транспортировки клинического материала. Однако при диагностике могут допускаться и другие ошибки, которые могут быть не замечены сотрудником КДЛ при анализе результатов.

Все ошибки, допускаемые в лабораторной практике, можно разделить на три класса:

• ошибки преаналитического этапа;

• ошибки аналитического этапа;

• ошибки постаналитического этапа.

Ошибки преаналитического этапа ПЦР-диагностики

Операции преаналитического этапа ПЦР-диагностики выполняются вне ПЦР-лабораторий, однако ошибки, допускаемые на этом этапе, оказывают едва ли не самое существенное влияние на результат исследования. Большинство этих ошибок невозможно определить в ходе исследования и, следовательно, существенно возрастает риск получения ложного результата. В связи с этим, необходима совместная работа с различными подразделениями ЛПУ по разработке алгоритма взятия биоматериала и контроль его выполнения.

Хранение биологического материала

Необходимо помнить о температуре хранения биологического материала, а также сроках и способах его доставки в ПЦР-лабораторию в случае, если транспортировка требует значительного времени. При нарушении сроков хранения или транспортировки биоматериала ДНК или РНК возбудителя может разрушаться, что приведет к ложноотрицательным результатам. Образцы рекомендуется хранить при температуре от 2 до 8 оС в течение нескольких часов, для более длительного хранения необходимо замораживание. Единственное исключение – кровь, поскольку цельную кровь замораживать нельзя! Необходимо получить плазму и уже ее замораживать. Заморозка должна быть однократной, в противном случае происходит разрушение нуклеиновых кислот.

Ошибки аналитического этапа ПЦР-диагностики

Ошибки в работе

Ошибки аналитического этапа, как правило, связаны с невнимательным чтением инструкции, прилагаемой к набору для проведния ПЦР-анализа.

Одной из таких ошибок является неправильный выбор системы пробоподготовки. Менее опасно применение экспресс-методов для сложных биоматериалов — таких как, например, плазма крови, потому что в этом случае

наиболее вероятно получение недостоверных результатов из-за оставшихся в

 

                                                   17

пробе ингибиторов ПЦР, что в свою очередь, вынудит специалиста КДЛ повторить эксперимент и выяснить причину неудачи. Гораздо опаснее, если из-за неправильно выбранной тест-системы в процессе пробоподготовки теряется

часть или вся ДНК или РНК возбудителя – в этом случае есть риск получения ложноотрицательного результата.

Контаминация.

Проблема контаминации возникает при неправильной организации лаборатории или при неаккуратном обращении с положительными образцами. Так, при использовании гель-электрофореза в качестве метода детекции, комната для его проведения обязательно должна иметь отдельный вход и систему вентиляции. В противном случае вероятность того, что ампликоны из открывающихся пробирок будут попадать в другие помещения, очень высока. Это может привести к тому, что со временем все больше исследуемых образцов на часто встречающиеся инфекции будут оказываться положительными. При этом на первых этапах такого загрязнения отрицательный контроль может оставаться чистым, поскольку появление ложноположительных результатов носит статистический характер.

В случае флуоресцентной детекции пробирки не открываются и теоретически вероятность контаминации близка к нулю, однако возможность ее открытия не исключена. Поэтому лучше, если амплификация и детекция будут проводиться в отдельной комнате, тогда в случае непредвиденной ситуации контаминированна окажется одна комната.

Еще одна ошибка, приводящая к контаминации образцов, связана с неаккуратным обращением как с клиническими пробами, так и с положительными контрольными образцами и стандартами. Некоторые специалисты лаборатории с целью экономии при внесении в большое количество пробирок одного и того же вещества используют один наконечник. Это нормально, если пробирки пустые или их содержание одинаково (подготовка амплификационных пробирок). Однако, если в пробирке находится образец, как, например, при пробоподготовке, то при внесении даже одного и того же раствора в разные пробирки увеличивается риск переноса ДНК между пробирками – так называемая кросс-контаминация. С целью предотвращения кросс-контаминации так же рекомендуется для внесения образцов, потенциально содержащих ДНК, использовать наконечники с фильтрами.

Ингибирование.

Чувствительность ПЦР может быть снижена вследствие многих причин,

 

                                                   18

наиболее важной из которых являетс я ингибирование реакции компонентами биологических образцов.

Ингибиторы ПЦР могут присутствовать в образцах крови (гемоглобин), мокроты, мочи, биопсийном материале. Различные вещества, например часто используемые антикоагулянты (особенно гепарин) или компоненты кровяных питательных сред, могут также подавлять реакцию амплификации ДНК.

                                                 

Ингибирование ПЦР обычно можно выявить путем искусственного добавления ДНК-мишени к исследуемому образцу и ее последующей амплификации. Отрицательный результат, полученный с заведомо положительным контролем, может говорить о наличии ингибиторов, для устранения которых необходимо использовать разведение образца или специальные методы подготовки проб.

Специфичность

                                 

Высокая                 

ГЛАВА 1. ОСНОВЫ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ

                       1.1.ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ О ПЦР                                                                                          

 

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) представляет собой метод ферментативной наработки определенных, сравнительно коротких (от нескольких десятков до нескольких тысяч пар нуклеотидов), двуцепочечных фрагментов ДНК. В основе реакции лежит механизм, который в природе реализован при внутриклеточном удвоении (репликации) молекул ДНК ферментом ДНК-полимеразой. Поскольку процесс репликации ДНК подробно описан во многих учебниках, здесь лишь напомним, что для протекания этой реакции (в клетке или пробирке) необходимы следующие ключевые компоненты: исходная молекула ДНК (служащая матрицей для репликации), ферментДНК-зависимая-ДНК-полимераза, дезоксирибонуклеотид трифосфаты и короткие одноцепочечные ДНК-затравки (праймеры), комплементарные матричной ДНК. Если все перечисленные компоненты смешать в соответствующем солевом растворе (буфере), ДНК-полимераза будет синтезировать ДНК из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов, подставляя их по принципу комплементарности к матричной молекуле ДНК начиная от ДНК-затравки.

При проведении ПЦР используют, как правило, два праймера, взаимодействующих (гибридизующихся) в соответствии с принципом комплементарности с противоположными цепями ДНК и ограничивающих участок матричной молекулы, который и будет амплифицирован в ходе реакции. Поскольку для гибридизации праймеров необходимо предварительно разъединить две цепи матричной молекулы ДНК, реакционную смесь нагревают до 93-96 градусов Цельсия. Затем смесь охлаждают до температуры, при которой праймеры могут провзаимодействовать с одноцепочечной матричной ДНК (40-75 градусов). После взаимодействия праймеров с матричной молекулой ДНК, полимеразы синтезирует комплементарную цепь ДНК путём удлинения праймеров (при температуре 60-75 градусов).

Если повторить нагрев и охлаждение реакционной смеси (цикл реакции), то ранее синтезированные молекулы ДНК выступят в качестве матриц для синтеза новых молекул, что приведет к увеличению ограниченного праймерами фрагмента вдвое. Многократное повторение таких температурных циклов ведёт к увеличению количества ограниченного праймерами участка ДНК в геометрической прогрессии с основанием, близким к 2.

Таким образом, классическая ПЦР состоит из повторяющихся температурных циклов, состоящих, в свою очередь, из трёх температурных режимов: 1) разрушение водородных связей между цепями ДНК (93-96

                                                  5

градусов); 2) гибридизация праймеров на ДНК (40-75 градусов); 3) синтез

комплиментарных цепей ДНК путём удлинения праймеров (60-75 градусов). В результате повторения циклов ПЦР, увеличение количества ограниченного праймерами фрагмента ДНК идёт в геометрической прогрессии, поскольку ранее синтезированные фрагменты на каждом цикле реакции выступают в качестве матриц для синтеза новых фрагментов. Как правило, для получения достаточного для детекции количества ДНК, в зависимости от начальной концентрации матриц в эффективности реакции, необходимо от 20 до 50 циклов ПЦР (считается, что даже с единственной стартовой молекулы за 40 циклов высокоэффективной ПЦР можно получить достаточное для детекции количество продукта реакции). В настоящее время реакцию проводят в специальных программируемых термостатах, автоматически меняющих температуру реакционной смеси по заданной программе. 

 

                    1.2.ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ ПЦР

 

 В начале 1970-х годов норвежский учёный Хьелль Клеппе из лаборатории нобелевского лауреата Хара Гобинды Кораны предложил способ амплификации ДНК с помощью пары коротких одноцепочечных молекул ДНК-синтетических праймеров. Однако в то время эта идея осталась нереализованной. Полимеразная цепная реакция (ПЦР) была изобретена в 1983 году американским биохимиком Кэри Муллисом. Его целью было создание метода, который бы позволил амплифицировать ДНК в ходе многократных последовательных удвоений исходной молекулы ДНК с помощью фермента ДНК-полимеразы. Первая публикация по методу ПЦР появилась в ноябре 1985 года в журнале “Science”. Через восемь лет после этого за изобретение метода ПЦР Кэри Муллис получил Нобелевскую премию. В начале использования метода после каждого цикла нагревания-охлаждения приходилось добавлять в реакционную смесь ДНК-полимеразу, так как она инактивировалась при высокой температуре, необходимой для разделения цепей спирали ДНК. Процедура проведения реакции была сравнительно неэффективной, требовала много времени и фермента.

В 1986 году метод полимеразной цепной реакции был существенно улучшен. Было предложено использовать ДНК-полимеразы из термофильных бактерий. Эти ферменты оказались термостабильными и были способны выдерживать множество циклов реакции. Их использование позволило упростить и автоматизировать проведение ПЦР. Одна из первых термостабильных ДНК-полимераз была выделена из бактерий Thermus aquaticus и названа Taq-полимеразой. Недостаток этой полимеразы заключается в довольно высокой вероятности внесения ошибочного

нуклеотида, так как у этого фермента отсутствуют механизмы исправления

ошибок (3’-5’-экзонуклеазная активность).

                                                  6

Полимеразы “Pfu” и “Pwo”, выделенные из архей, таким механизмом обладают, что их использование значительно уменьшает число мутаций в ДНК, но скорость их работы (процессивность) ниже, чем у “Taq”. Сейчас применяют смеси Taq и Pfu, чтобы добиться одновременно высокой скорости полимеризации и высокой точности копирования.

В момент изобретения метода Кэри Муллис работал химиком- синтетиком. Он синтезировал олигонуклеотиды, которые применялись тогда для выявления точечных мутаций методом гибридизации с геномной ДНК в компании Цетус (Cetus Corporation), которая и запатентовала метод ПЦР. В 1992 году Цетус продала права на метод и патент на использование Taq-полимеразы компании Хофман-Ла Рош за 300 млн долларов. Однако оказалось, что Taq-полимераза была охарактеризована советскими биохимиками А. Калединым, А. Слюсаренко и С. Городецким в 1980 году, а также за 4 года до этой советской публикации, то есть в 1976 году американскими биохимиками Алиц Чин, Девид Б., Эдгар и Джон, М. Трела. В связи с этим компания “Promega” пыталась в судебном порядке заставить Рош отказаться от исключительных прав на этот фермент. Американский патент на метод ПЦР истёк в марте 2005 года.  

 

                  1.3.ПРИНЦИП МЕТОДА ПЦР

                         

 

Все мы знаем, что ДНК — это двухцепочечная молекула, где каждая цепочка состоит из звеньев-нуклеотидов. Нуклеотиды составлены из трех молекул: остатка фосфорной кислоты, сахара и азотистого основания. Если сахар и фосфат одинаковы у всех нуклеотидов в ДНК (в РНК сахар другой), то азотистых оснований четыре (если не считать редкие модификации): аденин, тимин, цитозин и гуанин, обозначаемые А, Т, Ц и Г соответственно. В молекулах РНК тимин заменен урацилом. Нуклеотиды соединяются в цепочку, образуя связи между фосфатной группой одного нуклеотида и гидроксильной — другого. В результате на одном конце каждой цепи ДНК «висит» фосфатная группа (5ˊ -конец), а на другом — гидроксильная (3ˊ -конец). Две цепи нуклеотидов расположены в молекуле ДНК антипараллельно, то есть напротив 3ˊ -конца одной находится 5ˊ -конец другой. Чтобы молекула была стабильной, цепочки должны как-то взаимодействовать друг с другом. Это обеспечивают водородные связи, образующиеся между азотистыми основаниями противоположных цепей по принципу комплементарности: А соединяется только с Т (или У в РНК), а Г — с Ц. И поэтому, имея одну цепь ДНК, в соответствии с этим правилом легко построить ее пару. Собственно, на этом и основана ПЦР.

 

 

                                                    7

             1.4.КЛАССИФИКАЦИЯ ПЦР

                             Разновидности ПЦР

 

                         Конвенциональная ПЦР

 

В данном варианте постановки ПЦР реакция идет заранее выбранное число циклов (30-40), после чего анализируется, произошло ли накопление двуцепочечных молекул ДНК в реакционной смеси.

 

Данный вариант постановки ПЦР при использовании в качестве способа диагностики является качественным методом. Положительная реакция свидетельствует о наличии хотя бы следовых количеств искомых молекул ДНК в образце. Отрицательная реакция свидетельствует об их отсутствии. Количественная оценка содержания исходных молекул ДНК в образце невозможна из-за выхода реакции на плато.

 

Основным методом выявления наличия продукта является электрофорез в агарозном или полиакриламидном геле. Продукты ПЦР разделяются в геле под действием электрического поля в соответствии с их молекулярной массой. В гель добавляется интеркалирующий краситель (флуоресцирующий в связанном с двухцепочечной ДНК состоянии - чаще всего бромистый этидий). Таким образом, при облучении ультрафиолетом можно будет увидеть наличие или отсутствие полоски, соответствующей ДНК необходимой молекулярной

массы. При проведении ПЦР в диагностических целях всегда ставятся.                 положительный и отрицательный контроли реакции, с которыми сравниваются образцы.

 

                           ПЦР в реальном времени

 

В данном варианте постановки ПЦР количество продукта ПЦР в реакционной смеси регистрируется постоянно в ходе протекания реакции. Это позволяет построить кривую протекания реакции и, исходя из неё, рассчитать количество искомых молекул ДНК в образцах.

Один из видов проведения ПЦР в реальном времени – с использованием интеркалирующегокрасителя, который добавляется прямо в реакционную смесь (чаще всего используется SYBRGreen). Другой вид – с использованием одного из видов флуоресцирующих зондов, связывающихся с участком внутри ПЦР-продукта, что позволяет повысить специфичность обнаружения. Детекция флуоресценции происходит непосредственно в приборе в ходе протекания реакции.

 

                                          8

Помимо возможности количественного обнаружения, существуют и другие достоинства ПЦР в реальном времени по сравнению с конвенциональной. Данный вариант ПЦР более прост, быстр, а также не требует открывания пробирок с продуктами ПЦР, что уменьшает вероятность загрязнения других образцов. Основной недостаток – более высокая стоимость амплификатора со встроенной возможностью детекциифлуоресценции по сравнению с обычным.

 

                  Цифровая количественная ПЦР

 

Новый, дорогостоящий и пока малораспространенный вариант ПЦР, позволяющий более точно определять количество ДНК в образце.В данном варианте реакционная смесь, содержащая флуоресцентный краситель, разбивается на огромное число микроскопических объемов (например, капелек в эмульсии). После протекания ПЦР анализируется, в какой доле капелек реакция оказалась положительной и, соответственно, наблюдается флуоресценция. Эта доля будет пропорциональна числу искомых молекул ДНК в образце.

 

                  ПЦР с обратной транскрипцией

 

В данном случае перед тем или иным вариантом ПЦР производится реакция обратной транскрипции (РНК в ДНК) с использованием фермента ревертазы. Таким образом, этот метод позволяет проводить качественное или

 

                                            

количественное обнаружение молекул РНК. Это может использоваться для детекции РНК-содержащих вирусов или определения уровня транскрипции (количества мРНК) того или иного гена. 

 

123456Следующая ⇒

Поделиться: