Тесты на лекарственную чувствительность к препаратам первого ряда: стрептомицин, изониазид, рифампицин, этамбутол (SIRE)

Тесты на чувствительность к антибактериальным препаратам имеют исключительную важность для назначения эффективного лечения, особенно в случаях обнаружения лекарственной резистентности к противотуберкулезным препаратам. Они также важны для последующей коррекции антибактериальной терапии, в случае ее неэффективности.

Тест на чувствительность к препаратам - стрептомицину (S), изониазиду (I), рифампицину (R) и этамбутолу (E), сокращенно SIRE, проводимый при помощи прибора BACTEC MGIT 960, представляет собой быстрый и качественный метод определения чувствительности M. tuberculosis к четырем указанным лекарственным средствам в критически допустимых концентрациях. Кроме того, при необходимости можно проводить тесты с высокой концентрацией стрептомицина, изониазида и этамбутола.

Принципы проведения теста

Культуры, выделенные от пациентов, больных туберкулезом, выращиваются с добавлением известной концентрации тестового лекарственного препарата. Также используется контрольная пробирка без добавления лекарственного средства. Если изолят больного растет на контрольной пробирке, но не растет в среде с добавлением лекарственного препарата, он определяется как чувствительный к данному препарату. С другой стороны, если он растет в обеих пробирках, тем самым устанавливается его резистентность к указанному препарату.

Существуют несколько методов проведения теста на чувствительность, самый распространенный - метод пропорций. В таком методе резистентность для большинства лекарственных средств устанавливается на уровне 1 %. Это означает, что если общая тестируемая бактериальная популяция 1 % или более резистентна к лекарственному средству, она считается резистентной в клинических целях. На протяжении длительного времени в методе пропорций используется плотная агаровая среда Мидлбрук. После 3-4 недель инкубации для определения резистентности на среде, содержащей лекарственный препарат, подсчитывается процент колоний по сравнению со средой, в которой отсутствуют лекарственные препараты.

В 1980 г. был внедрен метод пропорции на основе бульона, известный под названием - радиометрический тест на чувствительность BACTEC 460 TB. В этом методе используется радиометрическая среда BACTEC 12B с субстратом класса C14.

Бактериальный инокулят в контрольном образце в 100 раз меньше инокулята в содержащей лекарственный препарат среде. CO₂, образующийся во время роста и метаболизма микобактерий в такой среде, измеряется и обозначается как индекс роста (Growth Index - GI). Как только GI в контрольном образце достигает значения 30 (обычно после 4-6 дней инкубации - максимум 1 2 дней), сравнение показателей GI в содержащей лекарственный препарат среде и не содержащей его является основой пропорции резистентности.

Тест на чувствительность с использованием BACTEC MGIT 960 был внедрен на основе аналогичных принципов, при этом увеличение флуоресценции в датчике измеряется автоматически и обозначается как значение роста (Growth Value - GV).

Если лекарственный препарат добавляется в среду, обладающую бактериостатическими или бактерицидными свойствами по отношению к тестируемым микобактериям, он ингибирует рост, таким образом, кислород поглощается либо в малых количествах, либо не поглощается совсем, поэтому отсутствует флуоресценция датчика. Результаты теста на лекарственную чувствительность, полученные при использовании системы BACTEC MGIT 960, идентичны данным, получаемым при помощи системы BACTEC 460TB, длительность исследования также примерно одинаковая. Концентрации лекарственных препаратов в тесте на чувствительность SIRE с использованием BACTEC MGIT 960 несколько ниже, чем в методе пропорций на плотной среде (во избежание ложных результатов чувствительности).

Тест на чувствительность BACTEC MGIT 960 был подвергнут детальной оценке путем сравнения со средой Мидлбрук 7H10, а также с системой BACTEC 460 TB System.

Тесты, применяемые при более высоких концентрациях лекарственных препаратов

Рекомендуется всегда тестировать лекарственные препараты ряда SIRE в критических концентрациях. Однако в некоторых ситуациях показано тестирование при более высокой концентрации. Оно играет роль для изолятов, имеющих низкий уровень резистентности, т.е. изолят проявляет резистентность при предельной концентрации, но чувствителен к высокой концентрации препарата. Поэтому во многих лабораториях сначала проводится тест при критической концентрации препарата, и в случае резистентности изолята он тестируется при высокой концентрации.

При высоких концентрациях тестируют только стрептомицин, изониазид и этамбутол. Из трех данных препаратов изониазид наиболее важен, поскольку врачи-клиницисты могут посчитать необходимым продолжить использование изониазида в терапевтическом режиме, если выделенная культура пациента резистентна при критической концентрации и чувствительна при высокой концентрации (т. н. " резистентность низкого уровня" ). В продаже имеются указанные высокие концентрации стрептомицина, изониазида и этамбутола для BACTEC MGIT 960.

Конечная концентрация препарата в среде должна быть следующей:

стрептомицин 4, 0 мг/мл среды

изониазид 0, 4 мг/мл среды

этамбутол 7, 5 мг/мл среды

Учет результатов

По завершении теста (4-21 день) на приборе появится сообщение о готовности результатов. Необходимо просканируйте штрих-код держателя и распечатать отчет. В распечатке прибора указаны результаты теста на чувствительность к каждому лекарственному препарату. Результаты имеют качественный характер: чувствительный (S), резистентный (R), либо результат теста не определен (X).

Прибор интерпретирует результаты, когда единица роста (GU) в контроле роста достигает значения 400 (в течение 4-13 дней). В этот момент оцениваются показатели единицы роста флакона с лекарственным препаратом.чувствительный - единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет менее 100.резистентный - единица роста пробирки с лекарственным препаратом составляет 100 и более.ошибка - неясные результаты, получаемые при определенных обстоятельствах, которые могут повлиять на процедуру теста, например, при достижении единицей роста контрольного образца величины ≥ 400 менее чем за 4 дня. В подобных случаях тест необходимо повторить с чистой, активнорастущей культурой, которая подтверждена как комплекс M. tuberculosis. Некоторые лекарственноустойчивые штаммы растут в среде очень медленно, и со стандартным инокулятом результаты могут быть не достигнуты в течение 13 дней. В таком случае необходимо также повторить исследование.

Глава 2. Материалы и методы исследования

 

Работа проводилась на базе бактериологической лаборатории Гомельской областной туберкулёзной клинической больницы (ГОТКБ).

В основу работы положены результаты 777 лабораторных исследований мокроты от больных с подозрением на туберкулез легких, направленных в бактериологическую лабораторию в период с мая 2009 г. по апрель 2010 г.

Основными задачами исследования была сравнительная оценка:

высеваемости МБТ на плотной среде Левенштейна-Йенсена и на жидкой среде с использованием автоматизированной системы BACTEC MGIT 960;

длительности микробиологического исследования на плотной среде и на BACTEC MGIT 960;

определения лекарственной чувствительности МБТ к ПТП на плотной среде Левенштейна - Йенсена и на жидкой среде с использованием автоматизированной системы BACTEC MGIT 960;

контаминации проб на плотной и жидкой питательных средах.

Материалы исследования

 

Образцы мокроты были взяты от больных с подозрением на туберкулез легких (777 проб) и направлены в бактериологическую лабораторию ГОТКБ. Основным критерием отбора проб являлся одновременный посев полученного материала на плотную (Левенштейна-Йенсена) и жидкую (BACTEC MGIT 960) среды.

Всего в ходе работы исследовано 777 (708 проб для оценки высеваемости и 69 проб для определения лекарственной чувствительности) образцов мокроты.

Для исследования применялись:

.   реактивы для приготовления питательной среды Левенштейна-Йенсена (приказ МЗ СССР № 558 от 08.06.78), реактивы из набора BACTEC MGIT 960.

2. аппараты для свертывания и инактивации сыворотки (АСИС).

.   Реактивы, использованные для деконтаминации мокроты в соответствии с инструкцией №787 от 29.08.07. по организации определения лекарственной чувствительности микобактерии туберкулёза.

.   Противотуберкулезные препараты для определения лекарственной устойчивости: изониазид, рифампицин, стрептомицин, этамбутол.

Методы исследования

 

Применялись следующие методы исследования:

.   Бактериологические методы: выделение МБТ, определение лекарственной чувствительности МБТ к ПТП.

2. Метод абсолютных концентраций для определения лекарственной чувствительности штаммов МБТ к противотуберкулезным препаратам. Определение лекарственной чувствительности МБТ к препаратам основного ряда с использованием автоматизированных систем (BACTEC MGIT 960) среды.

Предварительная обработка мокроты

Обработка мокроты 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия

Трехзамещенный фосфорнокислый натрий (Na₃PO₄) хорошо подавляет сопутствующую флору и даже при 2-3-х-дневном хранении материала при +4°С не повреждает микобактерии и мало влияет на их способность к росту на питательных средах.

Обработку материала 10% раствором трехзамещенного фосфорнокислого натрия производят следующим образом:

Исследуемый материал, находящийся в стерильном флаконе, заливают равным объемом 10% трехзамещенного фосфата натрия и помещают на 10 мин во встряхиватель, затем на 18-20 часов - в термостат при 37°C. После этого материал центрифугируют при 3000g в течение 15 минут. При указанном режиме происходит осаждение 95% присутствующих в материале микобактерий.

Надосадочную жидкость отбирают, осадок отмывают 10-15 мл изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды.

Супернатант удаляют, а осадок в объеме 0, 8-1, 0 мл засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

⇐ Предыдущая1234Следующая ⇒

Поделиться: