РАБОТА № 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ СУКЦИНАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: СДГ один из ключевых ферментов цикла трикарбоновых кислот, прочно связаный с внутренней мембранной митохондрий. Роль кофермента выполняет ФАД, соединенный с белком ковалентной связью. Фермент in vivo окисляет янтарную кислоту (сукцинат):

 

ФАД ФАДН₂

СООН СООН

СН2 СН

 

СН2 сукцинатдегидрогеназа СН

(СДГ)

СООН СООН

Сукцинат Фумарат

 

 

Работа дает представление о дегидрогеназных реакциях в ЦТК.

 

ПРИНЦИП МЕТОДА:

Субстрат – янтарная кислота. Конечный акцептор водорода – 2, 6-дихлорфенолиндофенол (синий цвет), который при восстановлении превращается в бесцветную лейкоформу. Источником фермента является отмытая мышечная ткань. В опыте (in vitro) ход реакций следующий:

 

Малонат является конкурентным ингибитором фермента СДГ.

ХОД РАБОТЫ:

 

А. Получение ферментного препарата.

2 г свежих мышц измельчают ножницами, гомогенизируют с небольшим количеством воды. Мышечную кашицу переносят на двойной слой марли (воронка) и промывают 25 мл воды. Отжатую мышечную массу переносят в пробирку, добавляют 4 мл воды, размешивают стеклянной палочкой и суспензию равномерно разливают в 4 пробирки.

 

Б. Определение активности фермента.

Взять четыре пробирки и приготовить инкубационные смеси в соответствии со схемой:

 

№ пробирки отмерить
Ферментный препарат (гомогенат ткани)     Н2О   Малонат   Сукцинат   2, 6-дихлорфенолиндофенол	1, 0 мл кипячение 2 минуты   0, 5 мл   -   1, 0 мл   2 капли	1, 0 мл -     0, 5 мл   -   1, 0 мл   2 капли	1, 0 мл -     1, 5 мл   -   -   2 капли	1, 0 мл -     -   0, 5 мл   1, 0 мл   2 капли
Перемешать. Инкубация 15 минут, при 37о С. в термостате

 

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

 

ВЫВОД:

 

РАБОТА № 2. ОПРЕДЕЛЕНИЕ АКТИВНОСТИ ЦИТОХРОМОКСИДАЗЫ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ: цитохромоксидаза является хромопротеином, содержит геминовую группу и Cu²⁺, активна в растительных и животных тканях, осуществляет перенос электронов на кислород в цепи тканевого дыхания. Определение активности фермента дает представление о функционировании цепи переноса электронов.

 

ПРИНЦИП МЕТОДА:

смесь a-нафтола и п-фенилендиамина (реактив «Нади») окисляется цитохромоксидазой в присутствии кислорода, образуя продукт конденсации индофеноловый синий по схеме:

 

 

ХОД РАБОТЫ:

А. Получение ферментного препарата.

0, 5 г свежих мышц растирают в ступке с 10 мл Н₂О. Воду сливают, мышечную ткань просушивают фильтровальной бумагой.

Б. Определение активности фермента.

Мышечную ткань разделяют на 2 части. Одну помещают на фильтр, другую переносят в пробирку, добавляют 1 мл Н₂О и кипятят 1 минуту. После охлаждения извлекают прокипяченную мышечную ткань стеклянной палочкой и помещают на фильтр.

На обе порции мышц наносят по 2 капли реактива «Нади» (смесь п-фенилендиамина и a-нафтола). Инкубация 5-10 минут, при 18^оС (комнатная).

РЕЗУЛЬТАТ:

ВЫВОД:

 

Дата: _______________

ЗАНЯТИЕ № 13

 

РАБОТА № 1. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАКРОЭРГИЧЕСКИХ СОЕДИНЕНИЙ МЫШЦ

ОБОСНОВАНИЕ ВЫПОЛНЕНИЯ РАБОТЫ:

главный макроэрг клеток человека и животных - АТФ образуется в реакциях окислительного и субстратного фосфорилирования АДФ. В мышцах содержится креатинфосфат-макроэрг, образующийся с участием АТФ. Оба вещества обеспечивают энергией мышцы при их сокращении.

 

 

 

ПРИНЦИП МЕТОДА:

богатые энергией два остатка фосфорной кислоты АТФ и фосфорный остаток креатинфосфата быстро отщепляются при гидролизе в кислой среде (лабильно связанный фосфор). Сравнение содержания неорганического фосфора, определяемого по цветной реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой до и после гидролиза, указывает на количество лабильно связанного фосфора макроэргов, что отражает количество макроэргических соединений в мышцах.

ХОД РАБОТЫ:

А. Выделение макроэргов из мышц.

0, 5 г мышцы гомогенизируют в 5 мл охлажденной 2, 5 % ТХУ во льду. Фильтруют в мерную пробирку, осадок на фильтре промывают 5 мл холодной Н₂О. Объем доводят до 10 мл.

 

Б. Определение лабильно связанного фосфора.

Взять две пробирки: контроль и опыт

 

ОТМЕРИТЬ	КОНТРОЛЬ	ОПЫТ
Безбелковый фильтрат   НСl, 1, 0 М     NaOH, 1, 0 M   H2O   Молибдат аммония, 1 % Аскорбиновая кислота, 1 %	0, 5 мл   1 мл     1 мл   2, 5 мл   0, 5 мл   0, 5 мл	0, 5 мл   1 мл Кипячение 10 минут, охладить 1 мл   2, 5 мл   0, 5 мл   0, 5 мл
	¯ Перемешать, инкубация 10 минут, при 18оС, (комнатная).   ¯ Колориметрия, λ = 640 нм, d = 1 cм, против контроля

 

РЕЗУЛЬТАТ:

 

Расчеты:

зная Ех, найти концентрацию фосфора в пробе по калибровочному графику. Конечный результат рассчитать по формуле:

Содержание макроэргов в мг АТФ/100 г ткани = А × 3, 3 × 400 × 100

 

ВЫВОД:

 

 

Содержание АТФ в мышцах: » 5 мкмоль АТФ в 1 г мышечной ткани в состоянии покоя (молекулярная масса АТФ равна 507, 2 г/моль).

 

 

Дата________________

ЗАНЯТИЕ № 14

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ АУДИТОРНАЯ РАБОТА

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: