Кворум - зависимые системы у бактерий

Стр 1 из 4Следующая ⇒

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.. 4

ВВЕДЕНИЕ. 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 7

1.1 Кворум - зависимые системы у бактерий. 7

1.1.1 Реакции кворум–сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов. 10

1.1.2 Реакции кворум–сенсинга у грамположительных микроорганизмов. 10

1.2 Фураноны как ингибиторы кворум - сенсинга. 12

1.3 Влияние биологически-активных веществ на физико-химические характеристики клетки. 13

1.4 Биопленки как фактор патогенности. 15

1.4.1 Биопленки в промышленности. 17

1.4.2 Влияние обработки поверхностей различными химическими средствами на формирование биопленок. 18

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 20

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.. 20

2.1 Штаммы, используемые в работе. 20

2.2 Соединения, которые применяли в работе. 20

2.3 Питательные среды и растворы.. 21

2.4 Методы определения токсичности и мутагенности веществ. 22

2.4.1 Тест на токсичность по отношению Salmonella typhimuium.. 22

2.4.2 Тест Эймса (Salmonella typhimurium) 23

2.5 Определение метаболитов в клетках и культуральной жидкости методом 1H-ЯМР-спектроскопии. 27

2.6 Определение способности к образованию биопленок по планшетному методу, описанному в статье «Growing and analyzing static biofilms» [Merritt, 2005] 28

2.7 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов 28

2.8 Оценка влияния фуранонов на морфологию клеток Serratia marcescens 30

2.9 Статистическая обработка результатов. 31

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 32

3.1 Токсические эффекты исследуемых соединений. 32

3.2 Мутагенные эффекты по отношению к Salmonella typhimuium.. 33

3.3 Результаты ЯМР-спектроскопии. 36

3.4 Определение способности к образованию биопленок по планшетному методу, описанному в статье «Growing and analyzing static biofilms» [Merritt, 2005] 43

3.5 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов 44

3.6 Морфологические изменения клеток Serratia marcescens при действии фуранонов 46

ВЫВОДЫ.. 48

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.. 50

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГЛ – ацилированный гомосеринлактон

ГСЛ – гомосеринлактон

ДМСО – Диметилсульфоксид

QS – quorum sensing

ВВЕДЕНИЕ

В последние 10-15 лет внимание многочисленных исследователей, работающих с микроорганизмами, было обращено на феномен, получивший название Quorum Sensing. В системе кворума участвуют молекулы гомосеринлактона. Фураноны- это аналоги гомосеринлактона. Quorum Sensing (QS) – это процесс, с помощью которого бактерии регулируют экспрессию генов, которые зависят от их плотности популяции. Этот процесс позволяет группам организмов выполнять скоординированные действия. Было показано, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками LuxR типа [Manefield, 2002].

Действие фуранонов приводит к подавлению различных клеточных процессов, регулируемых QS, например: биолюминесценции Vibrio fischeri; продукции факторов вирулентности у P. aeruginosa, Erwinia carotovora; образования биопленок. Например, формирование биопленки у Р. Aeroginosa находится под контролем реакции кворума. Для подавления инфекций, вызванных P.aeruginosa, растущих в биопленках, требуются существенно более высокие дозы антибиотиков. Микроколонии в зрелой биопленке расположены в матриксе. Например, Vibrio fischeri не светится, если плотность популяции низкая [Makris et al., 2009].

Выше сказанное свидетельствует о том, что изучение систем кворума представляет новое поле деятельности для исследователей в различных областях медицины и биологии. Изучение кворум-сенсинга различных микроорганизмов может открыть новые регуляции в клеточных процессах и механизмах. Приведенные данные показывают, что производные фуранонов перспективны для получения на их основе терапевтических агентов, которые направлены против патогенности бактерий. Большинство испытанных к настоящему времени соединений, способных подавлять QS-регуляцию, токсичны для человека [Hentzer, 2003], для микроорганизмов [Гимадеева, 2011], влияют на активность протеолитических ферментов [Маргулис, 2012].

Актуальную и перспективную задачу представляет модификация и поиск новых, нетоксичных веществ, пригодных для клинического применения. В связи с вышесказанным, целью работы явилась оценка влияния новых галогенированных производных фуранонов на физиологические и биохимические особенности Serratia marcescens.

В задачи входило:

1. Оценить токсические эффекты новых производных фуранонов.

2. Охарактеризовать мутагенные эффекты исследуемых фуранонов.

3. Описать влияние фуранонов на изменение состава метаболитов в клетках и культуральной жидкости Serratia marcescens.

4. Оценить влияние фуранонов на образование биопленок.

5. Охарактеризовать изменение состояния мембраны и морфологии клеток при действии фуранонов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Реакции кворум–сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов

Более чем у 450 видов грамотрицательных бактерий обнаружены кворум-зависимые системы, в которых сигнальными молекулами служат различные ацилгомосеринлактоны.

У грамотрицательных бактерий в большинстве кворум-зависимых систем аутоиндукторами (феромонами) служат ацилированные гомосеринлактоны. Они связываются c R-белками, а затем активируют транскрипцию генов, отвечающих за кворум-зависимые процессы. Если плотность бактериальных клеток достаточно высокая, то бактерии начинают вести какие-то новые процессы: например, морские бактерии Vibrio fischeri и Vibrio harveyi начинают светиться [Waters, 2005].

Система включает 2 основных блока генов. Ген luxI, входящий в один из блоков, кодирует белок (LuxI, 193 аминокислоты), который функционирует как синтаза химического агента межклеточной коммуникации, чьё накопление в среде сигнализирует клеткам V. fischeri о достижении пороговой плотности (кворума) для биолюминесценции. Агент коммуникации синтезируется из S-аденозилметионина и 3-оксогексаноил-кофермента А и представляет собой N-(3-оксогексаноил)-L-лактон гомосерина (3-ОГЛГ) [Олескин, 1999]. АГЛ осуществляют и межклеточную коммуникацию внутри одного вида бактерий, и межвидовую коммуникацию, а также взаимодействие между бактериями и высшими организмами. Понимание биологической активности АГЛ и экологических последствий такой деятельности, может дать нам возможность манипулировать составом и функциями сложных биологических комплексов.

Фураноны как ингибиторы кворум - сенсинга

После обнаружения эффекта фуранонов, образуемых D. pulchra, в различных лабораториях провели широкий скрининг природных соединений и химически синтезировали производные фуранонов, ингибиторов QS, в том числе производные фуранонов с ацильными цепями различной длины. Оказалось, что даже производные фуранонов без ацильной цепи с двумя атомами брома ингибировало QS-систему P. aeruginosa. Обнаружено, что производные фуранонов продуцируются различными организмами: морскими зелеными, красными и бурыми водорослями, грибами, асцидиями, актиномицетами и другие [Martinelli et al., 2004].

Изучение механизма действия этих веществ на QS системы показало, что соединения фураноновой природы конкурируют с АГЛ за участок связывания с рецепторными белками LuxR типа. Связывание фуранонов с рецептором влияет на стабильность комплекса белок-лиганд, приводя к быстрому расщеплению рецепторного белка [Manefield, 2002].

Действие фуранонов приводит к подавлению различных клеточных процессов, регулируемых QS: биолюминесценции Vibrio fischeri; продукции факторов вирулентности у P. aeruginosa, Erwinia carotovora; образования биопленок. Многие химически синтезированные фураноны значительно эффективнее, чем природные [Hentzer, 2003].

В последнее время появляются данные, что фураноны обладают следующими фармакологическими активностями:

- противовоспалительная;

- противоопухолевая;

- антибактериальная;

- противогрибковая;

- противопаразитарная;

- противовирусная;

- антиоксидантная [Sing et al., 2011].

Биопленки в промышленности

Биопленки вызывают серьезные трудности в промышленности, например:

- биокоррозия трубопроводов;

- обрастания технологического оборудования;

- обрастания нефтяных платформ.

В пищевой промышленности образование биопленок на продуктах питания повышает риск заражения патогенными микроорганизмами. В результате чего наблюдается возникновение инфекций у людей. В природных условиях могут вызывать ухудшение экологического состояния, например, изменения качества и чистоты воды [Биопленки].

Подземные воды используются в качестве ценного ресурса для питьевой воды в мире. Возрастающая антропогенная деятельность оказывает возрастающее давление на ресурсы подземных вод. Одним из последствий увеличения отбора подземных вод в сочетании с увеличением отбора воды в сухую погоду приводит к снижению уровня грунтовых вод в водоносных горизонтах. Биопленки в пределах водоносных горизонтов подземных вод обеспечивают защиту подземных вод путем удаления загрязнителей, поступающих в систему землепользования. Провели следующий эксперимент, влияние высыхания на биопленки, присутствующих в водоносных горизонтах подземных вод с использованием полевых и лабораторных экспериментов. В обоих экспериментах наблюдалось снижение активности ферментов (глюкозидазы, эстеразы и фосфатазы), но в высушенных образцах эффект сильнее проявляется по сравнению с влажными образцами. Тем не менее, сопоставляя все данные вместе, никаких существенных различий между образцами не было обнаружено.

Исследование показывает, что биопленки в системах подземных вод являются устойчивыми и могут выдерживать периоды высыхания [Weaver et al., 2015].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

1. Исследуемые галогенированные фураноны не оказывают токсических эффектов в отношении грамотрицательных бактерий в диапазоне концентраций от 0.1 до 100 мкг/мл, в то время как фуранон №9 и фуранон №10 в концентрациях от 0.1 до 100 мкг\мл привел к полному подавлению роста тестерного штамма Salmonella typhimurium.

2. Нами не обнаружены мутагенные эффекты исследуемых соединений в рабочем диапазоне концентраций.

3. ЯМР-химические сдвиги, соответствующие чистому фуранону 8, практически отсутствуют в обработанных образцах, что говорит о том, что вещество модифицировано.

4. В клетках без обработки фураноном в области 2.582-2.585 обнаруживается ЯМР-химический сдвиг, характерный для ароматических углеводородов. Обработка фураноном усиливает сигнал в клетках в 3-3.5 раза и в обработанной культуральной жидкости еще в 6-7 раз. При этом сам фуранон к тому времени не регистрируется.

5. Исследуемые нами фураноны препятствуют образованию биопленок.

6. Исследованные фураноны в низких концентрациях (0, 1) стимулируют переход клеточной мембраны из геля в жидкокристаллическое состояние.

7. Результаты экспериментов показали, что токсичный фуранон способствует разрушению клеток, внутреннее содержимое клеток выбрасывается наружу. Клетки, обработанные фураноном №11, более вытянуты, таким образом, возможно, фуранон влияет на деление клеток.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность к.х.н. доценту кафедры органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова КФУ – Курбангалиевой А.Р за синтезированные производные фуранона, проведение ЯМР-спектроскопии, д.б.н. профессору кафедры микробиологии Куриненко Б.М. за помощь в работе со спектрофлуориметром и обсуждение результатов, к.б.н. доценту каф. микробиологии Мардановой А.М. за участие в обсуждении результатов по биопленкообразованию, аспиранту кафедры микробиологии Митько В.Е. за участие в обсуждении результатов и к.б.н. ассистенту каф. зоологии беспозвоночных и функциональной гистологии Евтюгину В.Г. за фотографии и помощь в проведении электронной микроскопии.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Андреева, И. Н. Рост и пигментация Serratia marcescens [Текст] / И.Н. Андреева, Т.И. Огородникова // Микробиология.- 1999.- Т.68.- С. 16-20.

2. Антибактериальные поверхности / Линзы [Электронный ресурс].-2006.- Режим доступа: http: //www.optica4all.ru/index.php? catid. Дата доступа: 23.02.2015.

3. Аниськов, А.А. Определение строения карбо- и гетероциклических соединений спектральными методами [Текст] / А.А. Аниськов, И.Э. Варшаломидзе, А.Г. Голиков, О.А. Григорьева, И.Н. Клочкова, А.П. Кривенько, А.Ю. Никишин, Н.В. Поплевина, В.В. Сорокин, О.В. Федотова, Ю.А. Фомина, М.П. Щекина // Саратов: ИЦ «Наука», 2010.– 234с.

4. Биотехнологии /Медицинские материалы [Электронный ресурс].- 2008.- Режим доступа: http: //bio.freehostia.com. Дата доступа: 16.03.2014.

5. Биопленки / Биопленки, их строение и свойства [Электронный ресурс].-2009.- Режим доступа: http: //studopedia.net/10_19439_bioplenki-ih-stroenie-svoystva-vidi-sotsialnih-reaktsiy.html. Дата доступа: 14.02.2015.

6. Биопленки / Виды социальных реакций [Электронный ресурс].- 2007.- Режим доступа: http: //studopedia.net/10_19439. Дата доступа: 25.12.2014.

7. Биопленки и трубы / Диоксид хлора [Электронный ресурс].- 2005.-Режим доступа: http: //dutrion.com.ua/bio/moving.htm. Дата доступа: 25.02.2015.

8. Белоногова, Н.В. Галогенированные фураноны как модификаторы физиологической активности Staphylococcus aureus [Текст] / Н.В. Белоногова, Т.С. Бардина, В.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, А.Б. Маргулис, О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.- 2013.- Т.16.- С. 100-102.

9. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран [Текст] / Ю.А. Владимиров, Т.Е. Добрецов // М.- 1980. - 320 с.

10. Геннис, Р. Руководство по медицине [Текст] / Р. Геннис // Диагностика и терапия.- Москва: Мир, 1997.- 575с.

11. Гимадеева, Р.М. Цитотоксичность и генотоксичность новых производных фуранона / Р.М.Гимадеева, Э.В.Бабынин, А.Б.Маргулис // " Вестник Уральской медицинской академической науки" (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- С. 26.

12. Егоров, Н.С. Основы учения об антибиотиках [Текст] / Н.С.Егоров // Антибиотики.- Москва: Наука, 1986.- 374 с.

13. Зайцева, Ю. В. Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов [Текст]: автореф. дис. канд. биол. наук / Ю. В. Зайцева; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН – Москва, 2012. – 24 с.

14. Маргулис, А.Б. Влияние хлорпроизводных 2(5Н)-фуранона на жизнеспособность бактериальных клеток / А.Б.Маргулис, А.Р.Курбангалиева, Н.В.Белоногова, Л.З.Латыпова, В.Я.Пономарев, Э.Н.Хакимуллина, Е.Ю.Тризна, М.И.Богачев, А.Р.Каюмов // Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т. 15.- С. 220-224.

15. Маргулис, А.Б. Методы генетической токсикологии / А.Б. Маргулис, Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская // Учебно-методическое пособие.- Казань: КФУ, 2012.- 36 с.

16. Микробные биопленки / Катеторы [Электронный ресурс].- 2005.- Режим доступа: http: //dental-hygiene.ru/index.php? title. Дата доступа: 25.02.2015.

17. Мембрана / Оружие против микробов [Электронный ресурс].-2001.-Режим доступа: http: //www.membrana.ru/particle/7965. Дата доступа: 24.01.2015.

18. Медицинский портал /Внутриклеточный метаболизм и энергетический обмен [Электронный ресурс].- 2000.- Режим доступа: http: //www.miomed.ru/publ/ehndokrinologicheskaja_onkologija/. Дата доступа: 12.03.2014.

19. Митько, В.Е. Производные фуранонов как ингибиторы плотностно-зависимых процессов у бактерий [Текст] / В.Е.Митько, А.В.Гарусов, О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // " Вестник Уральской медицинской академической науки" (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- С. 41.

20. Научный сайт. Фосфолипиды / Найка // Влияние фосфолипидов на мембрану [Электронный ресурс].- 2006.- Режим доступа: http: //www.bsu.ru/content/hecadem/bahanova_mv/. Дата доступа: 12.03.2014.

21. Олескин, А. В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях [Текст] /А. В. Олескин // Микробиология.- 1993.- Т.62.- С.389-403.

22. Олескин, А. В. Политический потенциал современной биологии [Текст] / А. В. Олескин // Вестн. Росс. Акад. Наук. - 1999. - С.35-41.

23. Преч, Э. Определение строения органических соединений [Текст] / Э.Преч, Ф.Бюльманн, К.Аффольтер // М.: Мир, 2006. − 439с.

24. Пигменты / Пигменты бактерий и грибов [Электронный ресурс].- 2009.-Режим доступа: http: //micro.moy.su/publ/pigmenty_bakterij. Дата доступа: 18.02.14.

25. Система гормональной регуляции / Виды, пути и механизмы действия гормонов Гормоны [Электронный ресурс].- 2009.- Режим доступа: http: //andarcome.moy.su/news/sistema_gormonalnoj_reguljacii/. Дата доступа: 12.03.2014.

26. Стволовые клетки / Подавление аутоиндукторов [Электронный ресурс].- 2001.- Режим доступа: http: //reftrend.ru/346242.html. Дата доступа: 23.02.2015.

27. Ames, B. N. An improved bacterial test system for defection and classification of mutagens and carcinogens [Text] / B. N. Ames, F. D. Lee, W. E. Durston // Procl. Nac. Akad. Sci.- USA.- 1973.- V.70, N3.- P. 782.

28. Bakkiyaraj, D. Inhibition of quorum sensing regulated biofilm formation in Serratia marcescens causing nosocomial infections [Text] / D. Bakkiyaraj, C. Sivasankar, S.K. Pandian // Bioorg Med Chem Lett – 2012.-V.22.- P.3089-3094.

29. Bedmar, E. J. Detection, purification and characterisation of quorum-sensing signal molecules in plant-associated bacteria [Text] / E.J. Bedmar, G. Brelles-Marino // Biotechnol – 2001.- V.91.- P. 197-209.

30. Сarnes, E. C. Confinement-induced quorum sensing of individual Staphylococcus aureus bacteria [Text] / E.C. Carnes // Nature Chemical Biology – 2010. – V. 6.- P. 41-45.

31. Crone, S. A novel in vitro wound biofilm model used to evaluate low-frequency ultrasonic-assisted wound debridement [Text] / S. Crone, C. Garde, T. Bjarnsholt, M. Alhede // Microbiology – 2015.-V.10.-P.64-72.

32. Decho, A. W. Quorum sensing in natural environments: emerging views from microbial mats [Text] / A.W. Decho // Trends in Microbiology – 2010.-V. 18.-P. 73-80.

33. Fuqua, W. C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators [Text] / W. C. Fuqua, S. C. Winans, E. P. Greenberg // J. Bacteriol. - 1994. - V.176. - N. 2. - P.269-275.

34. Fux, C.A. Survival strategies of infectious biofilms [Text] / C.A.Fux, J.W.Costerton, P.S.Stewart, P.Stoodley // Trends Microbiol.- 2005.- V.13.- P. 34–4

35. Gray, K. M. Intercellular communication and group behavior in bacteria [Text] / K. M. Gray // Trends Microbiol - 1997. - V.5. - N 5. - P.184-188.

36. Hentzer, M. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors [Text] / M. Hentzer, H. Wu, J.B. Andersen, K. Riedel, T.B. Rasmussen, N. Bagge, N. Kumar, M.A. Schembri, Z. Song, P. Kristoffersen, M. Manefield, J.W. Costerton, S. Molin, L. Eberl, P. Steinberg, S. Kjelleberg, N. Hoiby, M. Givskov // The EMBO J. – 2003. V. 22.- P. 3803-3815.

37. Hentzer, M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections [Text] / M. Hentzer, M. Givskov // J. Clin. Invest – 2003. V.112.-P. 1300-1307.

38. Hirschfeld, J. Dynamic interactions of neutrophils and biofilms [ Text] / J. Hirschfeld // Oral Microbiol -2014.-V.6.-P. 247-248.

39. Nadell, C. Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms [Text] / C. Nadell, K. Drescher, N. Wingreen, B. Bassler // Microbiology – 2015.- V. 1038.-P. 246-247.

40. Makris, C. Critical Population Density Triggers Rapid Formation of Vast Oceanic Fish Shoals [Text] / C. Makris, P. Ratilal, S.Jagannathan, Z.Gong, M. Andrews, I. Bertatos, O.Rune, R.Nero // Science – 2009. V.323.- P. 1734-1737.

41. Manefield, M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover [Text] / M. Manefield, T.B. Rasmusen, M. Hentzer, J.B. Anderson, P. Steinberg, S. Kjelleberg, M. Givskov // Microbiology – 2002. V.148.- P.1119-1127.

42. Manefield, M. Evidence that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein [Text] / M. Manefield, R. de Nys, N. Kumar, R. Read, M. Givskov, P. Steinberg, S. Kjelleberg // Microbiology – 1999. V.145.-P. 283-291.

43. Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum [Text] / D. Martinelli, G. Grossmann, U. Sequin, H. Brandl, R. Bachofen // BMC Microbiology – 2004. No.4, V.25.

44. Maron D. M. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test [Text] / D. M. Maron, B. N. Ames //Mutat. Res.- N113.- 1983.- P.174-210.

45. Miller, M. Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. [Text] / M. Miller, B. Bassler // Microbiology – 2001. V.55.-P. 319-346.

46. Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum [Text] / D. Martinelli, G. Grossmann, U. Sequin, H. Brandl, R. Bachofen // BMC Microbiology – 2004. No.4, V.25.

47. Novick, R. Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Microbiol [ Text] / R. Novick // Microbiology- 2003. V. 48.-P. 1429-1449.

48. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance [Text] / I. Olsen // Microbiol Infect – 2015.- V. 154.- P.317-318.

49. Rosemeyer, V. lux I- and luxR-homologous genes of Rhizobium etli CNPAF512 contribute to synthesis of autoinducer molecules and nodulation of Phaseolus vulgaris [Text] / V. Rosemeyer, J. Michiels, C. Verreth, J. Vanderleyden// J. Bacteriol. - 1998. - V.180. - N 4. - P.815-821.

50. Saygili, N. Synthesis of New 3-Pyrrolin-2-One Derivatives [Text] / N.Saygili, A.Altunbas, A.Yesilada, N.Saygili // Turk. J. Chem.- 2006.- V. 30.- P. 125-130.

51. Schineller, J. B. Transcriptional regulation of bioluminesence genes from Vibrio fischeri [Text] / J.B. Schineller, D.M. Sitnikov, T.O. Baldwin // Mol Microbiol – 1995.- V.17.- P. 801- 812.

52. Shapiro, J. A. The significances of bacterial colony patterns [Text] / J. A. Shapiro // BioEssays. - 1995. - V. 17. - N 7. - P. 597-607.

53. Sing, S. Furanone derivatives: diverse biological activities [Text] / S. Sing, P.K. Sharma, N. Kumar, R. Dudhe // An international journal of pharmaceutical sciences.- 2011.- P.1036-1046.

54. Tao, Y. The function of SpnR and the inhibitory effects by halogenated furanone on quorum sensing in Serratia marcescens AS-1 [Text] / Y. Tao, T. Morohoshi, N. Kato, T. Ikeda, H. Zhuang // Wei Sheng Wu – 2008.-V.48.- P. 391-397.

55. Townsley, L. Temperature affects c-di-GMP signaling and biofilm formation in Vibrio cholerae [Text] / L. Townsley, F.H. Yildiz // Environ Microbiol – 2015.-V. 10.-P. 343-345.

56. Weaver, L. Biofilm resilience to desiccation in groundwater aquifers: A laboratory and field study [Text] / L. Weaver, J. Webber, A. Hickson, P. Abraham, M. Close // Sci Total Environ – 2015.- V.514.-P. 281-289.

57. Waters, C. Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. [Text] / Waters, C de B. Bassler // Microbiology – 2005. V.25.-P. 319-346.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.. 4

ВВЕДЕНИЕ. 5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.. 7

1.1 Кворум - зависимые системы у бактерий. 7

1.1.1 Реакции кворум–сенсинга у грамотрицательных микроорганизмов. 10

1.1.2 Реакции кворум–сенсинга у грамположительных микроорганизмов. 10

1.2 Фураноны как ингибиторы кворум - сенсинга. 12

1.3 Влияние биологически-активных веществ на физико-химические характеристики клетки. 13

1.4 Биопленки как фактор патогенности. 15

1.4.1 Биопленки в промышленности. 17

1.4.2 Влияние обработки поверхностей различными химическими средствами на формирование биопленок. 18

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ. 20

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.. 20

2.1 Штаммы, используемые в работе. 20

2.2 Соединения, которые применяли в работе. 20

2.3 Питательные среды и растворы.. 21

2.4 Методы определения токсичности и мутагенности веществ. 22

2.4.1 Тест на токсичность по отношению Salmonella typhimuium.. 22

2.4.2 Тест Эймса (Salmonella typhimurium) 23

2.5 Определение метаболитов в клетках и культуральной жидкости методом 1H-ЯМР-спектроскопии. 27

2.7 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов 28

2.8 Оценка влияния фуранонов на морфологию клеток Serratia marcescens 30

2.9 Статистическая обработка результатов. 31

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. 32

3.1 Токсические эффекты исследуемых соединений. 32

3.2 Мутагенные эффекты по отношению к Salmonella typhimuium.. 33

3.3 Результаты ЯМР-спектроскопии. 36

3.5 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов 44

3.6 Морфологические изменения клеток Serratia marcescens при действии фуранонов 46

ВЫВОДЫ.. 48

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ.. 50

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АГЛ – ацилированный гомосеринлактон

ГСЛ – гомосеринлактон

ДМСО – Диметилсульфоксид

QS – quorum sensing

ВВЕДЕНИЕ

В задачи входило:

1. Оценить токсические эффекты новых производных фуранонов.

2. Охарактеризовать мутагенные эффекты исследуемых фуранонов.

4. Оценить влияние фуранонов на образование биопленок.

5. Охарактеризовать изменение состояния мембраны и морфологии клеток при действии фуранонов.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Кворум - зависимые системы у бактерий

Понятие Quorum Sensing было предложено в 1994 году. Термин Quorum Sensing наводит на мысль, что высокие плотности бактериальной популяции, скорее всего, связаны с повышенными концентрациями ключевой молекулы. Это позволяет предположить, что определенные бактерии могут использовать систему кворума для координации своего поведения в соответствии с минимальной плотностью популяции. Бактерии традиционно рассматривали как простые одноклеточные организмы, мы теперь знаем, что бактериальные популяции и сообщества часто демонстрируют слаженные действия, такие как: межвидовые и внутривидовые коммуникации, сотрудничества и другие [Carnes, 2010].

Феномен клеточной плотности, зависящий от контроля экспрессии генов, называемых аутоиндукцией, уже давно является предметом интереса и исследования в области биолюминесценции морских бактерий. Теперь становится ясно, что многие бактерии, в том числе животные и растения используют аутоиндукцию для регулирования различных процессов. Плотность-зависимая экспрессия генов является превосходным примером многоклеточного поведения в царстве прокариот, где одна клетка способна осуществлять коммуникацию. Регулирование бактериальной биолюминесценции изучалось в течение многих лет и представляет лучшие модели для понимания механизма плотно-зависимой экспрессии [Schineller et al., 1995].

Интересными в данном аспекте являются производные фуранонов, которые по сути представляют из себя аналоги гомосеринлактонов, обладающие антагонистическими эффектами за счет связывания и встраивания вместо гомосеринлактонов в реакциях кворум-сенсинга [Manefield, 1999]. Отсюда все больше внимания учёных привлекает исследования биологической активности галогенированных фуранонов.

Известны механизмы многих из этих процессов, определены факторы межклеточной коммуникации, отвечающие за процессы, зависящие от плотности популяции [Олескин, 2000].

Изучение механизмов кворум-реакций открывает новые возможности для предупреждения и лечения болезней, вызванных микробными агентами.

Механизмы реакций кворум-сенсинга различаются у грамположительных и грамотрицательных бактерий [Олескин, 2000].

Quorum sensing позволяет бактериям следить за плотностью популяции. QS опирается на взаимодействие аутоиндуктора с активатором транскрипции белка. Эти сигнальные молекулы диффундируют из бактериальных клеток и накапливаются в окружающей среде. Как только пороговое значение концентрации достигает своего максимума, эти сигналы служат индукторами для регуляции целевых генов. У грамотрицательных бактерий аутоиндукторы относятся к семейству ацилированных гомосеринлактонов. Ацилированные гомосеринлактоны в межклеточной коммуникации играют роль в регулировании различных функций, таких как биосинтез антибиотика, продукция факторов вирулентности, биосинтез экзополисахаридов и другие [Bedmar et al., 2001].

Было показано, что фураноны ингибируют экспрессию бактериальных экзоферментов, которые активно разрушают компоненты иммунной системы, таким образом, усиливая иммунную реакцию [Decho, 2010]. Например, Serratia marcescens – это оппортунистический патоген, вызывающий тяжелые инфекции мочевыводящих путей. Инфекции, вызываемые Serratia marcescens, представляют большой интерес из-за устойчивости к анбитиотикам. Межклеточные коммуникации (QS системы) Serratia marcescens выступают в качестве глобального регулятора почти всех факторов вирулентности, в основном, например, образование биопленок. Так, QS системы Serratia marcescens обеспечивают улучшение стратегии в борьбе с лекарственной устойчивостью [Bakkiyaraj et al., 2012]. По секреции и выявлению ряда сигнальных молекул, бактерии способны координировать экспрессию генов. Широко использованный сигнальный механизм – система - кворума. Известны несколько систем, описанные для Serratia marcescens. Галогенированные фураноны, известные как ингибиторы кворума, эффективно подавляют кворум-системы Serratia marcescens.Было высказано, галогенированные фураноны тормозят систему кворума и возможности применения их в предотвращении инфекций, вызванные серрацией [Tao et al., 2008].

Кворум бактерии вырабатывают и высвобождают химические сигнальные молекулы, называемые аутоиндукторами, увеличение концентрации влияет на клеточную плотность. При максимальной плотности популяции происходит выброс аутоиндуктора. Обнаружение минимального порога концентрации аутоиндуктора приводит к экспрессии генов. Грамположительные и грамотрицательные бактерии используют различные кворум системы для регулирования различных физиологических функций. Эти процессы включают в себя симбиоз, вирулентность, компетентность, подвижность, спорообразование и образование биопленок. Последние достижения в этой области свидетельствуют о том, что межклеточные связи через аутоиндукторы происходит как внутри, так и между видами. Хотя природа химических сигналов, сигнальных механизмов и целевых генов, контролируемых бактериальной кворум-системой отличаются, но в каждом случае возможность взаимодействовать друг с другом позволяет бактериям координацию экспрессии генов, и, следовательно, поведение всей популяции [Miller et al., 2001].

12 3 4 Следующая ⇒

Последнее изменение этой страницы: 2017-04-12; Просмотров: 831; Нарушение авторского права страницы