Результаты ЯМР-спектроскопии

⇐ ПредыдущаяСтр 4 из 4

Контрольную и обработанную фураноном культуру Serratia marcescens после образования пигмента (4 сутки) центрифугировали и делили на две фракции: клетки и культуральная жидкость. Предварительно было определено количество клеток в камере Горяева (М= 350*10⁴) и была замерена оптическая плотность (Dopt. = 0.287 нм).

Далее были подготовлены образцы для ЯМР-спектроскопии (обработка проводилась Фураноном 8):

1- Клетки в физ.растворе – без фуранона;

2- Клетки в физ.растворе – с фураноном;

3- Надосадочная жидкость – без фуранона;

4- Надосадочная жидкость – с фураноном;

5- Чистый бульон (контроль)

6- Фуранон 8, концентрация 10 мкг/мл.

На рисунке 7 представлен спектр Ф8 в дейтерированном хлороформе.

Рисунок 7 – Раствор фуранона F8 в ДМСО (Растворитель (ДМСО) был досуха вакуумирован, и полученный остаток был растворен в дейтерохлороформе). Здесь и далее: ось 0Х – область ЯМР-химического сдвига, ось 0Y – интенсивность сигнала.

На рисунке видно, что основные пики фуранона в спектре приходятся на области 3.5, 4 и 4.2 ppm.

На рисунке 8, заимствованном из диссертации Гурьянова Ивана Дмитриевича (каф. микробиологии КФУ), представлен ЯМР-спектр очищенного продигиозина, снятый в дейтерированном хлороформе.

Рисунок 8 – ЯМР-спектр очищенного пигментного препарата – продигиозина.

ЯМР-химические сдвиги продигиозина были следующими: 0.92 p.p.m., 1.31 p.p.m., 1.33 p.p.m., 1.60 p.p.m, 2.40 p.p.m., 2.55 p.p.m., 4.00 p.p.m., 6.08 p.p.m., 6.35 p.p.m., 6.68 p.p.m., 6.99 p.p.m., 7.27 p.p.m., 7.55 p.p.m.

На рисунках 9-13 представлены спектры исследуемых образцов, включая контрольный (бульон). Проанализировав спектры, мы выяснили, что ЯМР-химические сдвиги, соответствующие чистому фуранону, практически отсутствуют в обработанных образцах, что говорит о том, что вещество метаболизировано. Также мы видим ЯМР-химические сдвиги в области, схожей со сдвигами, характерными для продигиозина. Характерно, что в образце КЖ, обработанной фураноном, эти сдвиги более очевидны.

Рисунок 9 - Спектр ЯМР ¹Н образца №1 (клетки бактерий без обработки фураноном) в D₂O.

Рисунок 10 - Спектр ЯМР ¹Н образца №2 (клетки бактерий после обработки фураноном) в D₂O.

Рисунок 11 - Спектр ЯМР ¹Н образца №3 (надосадочная жидкость без фуранона, от образца №1) в D₂O.

Рисунок 12 - Спектр ЯМР ¹Н образца №4 (надосадочная жидкость после обработки фураноном, от образца №2) в D₂O.

Рисунок 13 - Спектр ЯМР ¹Н образца №5 (чистый бульон (контроль)) в D₂O.

Наиболее интересным результатом нам представляется наличие ЯМР-химического сдвига в области 2.582-2.585. Этот сдвиг отсутствует в контрольном варианте, а также отсутствует в КЖ без обработки фураноном. Мы видим его в образце клеток без обработки фураноном, однако сигнал незначительный. В вариантах для клеток с обработкой фураноном этот сигнал становится гораздо более выраженным (увеличение в 3-3.5 раза), а особенно в образце КЖ (возрастает еще в 6-7 раз по сравнению с обработанными клетками). Стоит отметить, что этот сигнал отсутствует в образце чистого фуранона. Мы предполагаем, что этот ЯМР-химический сдвиг может характеризовать некий комплекс метаболитов, синтезируемый клетками Serratia в небольших количествах, практически не выделяющийся в среду. Однако обработка клеток фураноном приводит к резкому увеличению его синтеза и активному выделению в КЖ. В настоящий момент, исходя из области сдвига, мы можем предварительно охарактеризовать его как комплекс ароматических углеводородов [Аниськов с соавт., 2010; Преч, 2006].

3.4 Определение способности к образованию биопленок по планшетному методу, описанному в статье «Growing and analyzing static biofilms» [Merritt, 2005]

Способность к образованию биопленок показаны в таблице 1.

Таблица 1 – Влияние фуранонов на формирование биопленок

Концентр.	Ф7	Ф8	Ф9	Ф10	Ф11	Ф12	Ф13	Ф14
	61%	66%			64%	81%	61%	55%
	56%	54%			59%	64%	42%	45%
	49%	51%			59%	57%	46%	44%
0, 1	49%	44%	65%	79%	57%	56%	48%	56%
0, 01			64%	62%
0, 001			49%	55%
Контроль	100%

Влияние фуранонов на образование биопленок показаны на рисунке 14.

Рисунок 14 – Способность к образованию биопленок.

Как видно из графика, полученные нами значения меньше, чем в контрольном варианте. Это свидетельствует о том, что исследуемые фураноны препятствуют образованию биопленок. Фуранон №9 в концентрации 0, 001 в большей степени способен подавлять образование биопленок. А фуранон №10 в концентрации 0, 1 в меньшей степени подавляет образование биопленок.

3.5 Определение изменения микровязкости мембраны при действии фуранонов

Показано, что интенсивность флуоресценции эксимера пирена клеточной суспензии после добавления фуранона №10 в концентрации 0, 1 мкг\мл, рассчитанная как = (I470_пир-I470_б\пир)- I470_ф/пир=37, 59 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера, рассчитанная по формуле (I370_пир-I370_б\пир)-I370_ф/пир=32, 53 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=37, 59/32, 53=1, 155.

Интенсивность флуоресценции эксимера пирена клеточной суспензии после добавления фуранона №9 (токсичный) в концентрации 0, 1 мкг\мл, рассчитанная как = (I470_пир-I470_б\пир)-I470_ф/пир=30, 99 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера, рассчитанная по формуле (I370_пир-I370_б\пир)-I370_ф/пир=44, 21 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F= 30, 99/44, 21=0, 701.

Интенсивность флуоресценции эксимера клеточной суспензии без добавления фуранона, рассчитанная аналогичным образом равна 20, 55 усл.ед. Интенсивность флуоресценции мономера этой же клеточной суспензии равна 47, 98 усл.ед. Коэффициент эксимеризации F=20, 55/47, 98=0, 43.

Известно, что интенсивность эксимеризации обратно пропорциональна микровязкости мембраны [Добрецов, 1989]. Иными словами, увеличение коэффициента эксимеризации пирена в присутствии фуранона свидетельствует о том, что они способны воздействовать на мембрану Micrococcus lysodeikticus.

1. С пиреном не взаимодействует соотношение I470/370 (возбуждение 340)=0, 135 для фуранона №9 и 0, 1302 для фуранона №10 (результат измерений фуранонов с пиреном без клеток).

2. Интересно то, что фураноны, особенно Ф10, увеличивают коэффициент эксимеризации. У клеток коэффициент эксимеризации без фуранонов =0, 43; с фураноном Ф9 коэффициент эксимеризации =0, 7, а для Ф10 коэффициент эксимеризации=1, 155. Это свидетельствует о стимуляции фуранонами перехода мембраны в жидкокристаллическое состояние (о том, что в присутствии фуранонов больше доменов мембраны в жидкокристаллическом состояние, чем в гель-состоянии).

3.6 Морфологические изменения клеток Serratia marcescens при действии фуранонов

Влияние фуранонов на морфологию клеток показано на рисунках 15-17.

Рисунок 15 – Контрольный вариант клеток Serratia marcescensбез обработки фураноном.

Рисунок 16 – Клетки Serratia marcescens, обработанные фураноном №11 (нетоксичным) в концентрации 100 мкг\мл.

Рисунок 17 – Клетки Serratia marcescens, обработанные токсичным фураноном №9 в концентрации 0, 1 мкг\мл.

Результаты показали, что токсичный фуранон способствует разрушению клеток, внутреннее содержимое клеток выбрасывается наружу. Клетки, обработанные фураноном №11, более вытянуты, возможно, фуранон влияет на деление клеток. После обработки фураноном №11 клетки малоотличимы от контрольного варианта, но в контрольном варианте регистрируются меньшие размеры клеток.

ВЫВОДЫ

1. Исследуемые галогенированные фураноны не оказывают токсических эффектов в отношении грамотрицательных бактерий в диапазоне концентраций от 0.1 до 100 мкг/мл, в то время как фуранон №9 и фуранон №10 в концентрациях от 0.1 до 100 мкг\мл привел к полному подавлению роста тестерного штамма Salmonella typhimurium.

2. Нами не обнаружены мутагенные эффекты исследуемых соединений в рабочем диапазоне концентраций.

3. ЯМР-химические сдвиги, соответствующие чистому фуранону 8, практически отсутствуют в обработанных образцах, что говорит о том, что вещество модифицировано.

4. В клетках без обработки фураноном в области 2.582-2.585 обнаруживается ЯМР-химический сдвиг, характерный для ароматических углеводородов. Обработка фураноном усиливает сигнал в клетках в 3-3.5 раза и в обработанной культуральной жидкости еще в 6-7 раз. При этом сам фуранон к тому времени не регистрируется.

5. Исследуемые нами фураноны препятствуют образованию биопленок.

6. Исследованные фураноны в низких концентрациях (0, 1) стимулируют переход клеточной мембраны из геля в жидкокристаллическое состояние.

7. Результаты экспериментов показали, что токсичный фуранон способствует разрушению клеток, внутреннее содержимое клеток выбрасывается наружу. Клетки, обработанные фураноном №11, более вытянуты, таким образом, возможно, фуранон влияет на деление клеток.

Благодарности

Автор выражает глубокую благодарность к.х.н. доценту кафедры органической химии Химического института им. А.М. Бутлерова КФУ – Курбангалиевой А.Р за синтезированные производные фуранона, проведение ЯМР-спектроскопии, д.б.н. профессору кафедры микробиологии Куриненко Б.М. за помощь в работе со спектрофлуориметром и обсуждение результатов, к.б.н. доценту каф. микробиологии Мардановой А.М. за участие в обсуждении результатов по биопленкообразованию, аспиранту кафедры микробиологии Митько В.Е. за участие в обсуждении результатов и к.б.н. ассистенту каф. зоологии беспозвоночных и функциональной гистологии Евтюгину В.Г. за фотографии и помощь в проведении электронной микроскопии.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

1. Андреева, И. Н.Рост и пигментация Serratia marcescens [Текст] / И.Н. Андреева, Т.И. Огородникова // Микробиология.- 1999.- Т.68.- С. 16-20.

2. Антибактериальные поверхности/ Линзы [Электронный ресурс].-2006.- Режим доступа: http: //www.optica4all.ru/index.php? catid. Дата доступа: 23.02.2015.

3. Аниськов, А.А. Определение строения карбо- и гетероциклических соединений спектральными методами [Текст] / А.А. Аниськов, И.Э. Варшаломидзе, А.Г. Голиков, О.А. Григорьева, И.Н. Клочкова, А.П. Кривенько, А.Ю. Никишин, Н.В. Поплевина, В.В. Сорокин, О.В. Федотова, Ю.А. Фомина, М.П. Щекина // Саратов: ИЦ «Наука», 2010.– 234с.

4. Биотехнологии/Медицинские материалы [Электронный ресурс].- 2008.- Режим доступа: http: //bio.freehostia.com. Дата доступа: 16.03.2014.

5. Биопленки/ Биопленки, их строение и свойства [Электронный ресурс].-2009.- Режим доступа: http: //studopedia.net/10_19439_bioplenki-ih-stroenie-svoystva-vidi-sotsialnih-reaktsiy.html. Дата доступа: 14.02.2015.

6. Биопленки /Виды социальных реакций [Электронный ресурс].- 2007.- Режим доступа: http: //studopedia.net/10_19439. Дата доступа: 25.12.2014.

7. Биопленки и трубы/ Диоксид хлора [Электронный ресурс].- 2005.-Режим доступа: http: //dutrion.com.ua/bio/moving.htm. Дата доступа: 25.02.2015.

8. Белоногова, Н.В. Галогенированные фураноны как модификаторы физиологической активности Staphylococcus aureus [Текст] / Н.В. Белоногова, Т.С. Бардина, В.Я. Пономарев, А.И. Колпаков, А.Б. Маргулис, О.Н. Ильинская // Вестник Казанского технологического университета.- 2013.- Т.16.- С. 100-102.

9. Владимиров, Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран [Текст] / Ю.А. Владимиров, Т.Е. Добрецов // М.- 1980. - 320 с.

10. Геннис, Р.Руководство по медицине [Текст] / Р. Геннис // Диагностика и терапия.- Москва: Мир, 1997.- 575с.

11. Гимадеева, Р.М. Цитотоксичность и генотоксичность новых производных фуранона / Р.М.Гимадеева, Э.В.Бабынин, А.Б.Маргулис // " Вестник Уральской медицинской академической науки" (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- С. 26.

12. Егоров, Н.С.Основы учения об антибиотиках [Текст] / Н.С.Егоров // Антибиотики.- Москва: Наука, 1986.- 374 с.

13. Зайцева, Ю. В.Молекулярно-генетические особенности Quorum Sensing систем грамотрицательных бактерий (на модели Serratia) и изучение их роли в регуляции клеточных процессов [Текст]: автореф. дис. канд. биол. наук / Ю. В. Зайцева; Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной генетики РАН – Москва, 2012. – 24 с.

14. Маргулис, А.Б. Влияние хлорпроизводных 2(5Н)-фуранона на жизнеспособность бактериальных клеток / А.Б.Маргулис, А.Р.Курбангалиева, Н.В.Белоногова, Л.З.Латыпова, В.Я.Пономарев, Э.Н.Хакимуллина, Е.Ю.Тризна, М.И.Богачев, А.Р.Каюмов // Вестник Казанского технологического университета.- 2012.- Т. 15.- С. 220-224.

15. Маргулис, А.Б.Методы генетической токсикологии / А.Б. Маргулис, Н.С. Карамова, О.Н. Ильинская // Учебно-методическое пособие.- Казань: КФУ, 2012.- 36 с.

16. Микробные биопленки/ Катеторы [Электронный ресурс].- 2005.- Режим доступа: http: //dental-hygiene.ru/index.php? title. Дата доступа: 25.02.2015.

17. Мембрана/ Оружие против микробов [Электронный ресурс].-2001.-Режим доступа: http: //www.membrana.ru/particle/7965. Дата доступа: 24.01.2015.

18. Медицинский портал/Внутриклеточный метаболизм и энергетический обмен [Электронный ресурс].- 2000.- Режим доступа: http: //www.miomed.ru/publ/ehndokrinologicheskaja_onkologija/. Дата доступа: 12.03.2014.

19. Митько, В.Е. Производные фуранонов как ингибиторы плотностно-зависимых процессов у бактерий [Текст] / В.Е.Митько, А.В.Гарусов, О.Н.Ильинская, А.Б.Маргулис // " Вестник Уральской медицинской академической науки" (Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии и биотехнологии).- 2011.- С. 41.

20. Научный сайт.Фосфолипиды / Найка // Влияние фосфолипидов на мембрану [Электронный ресурс].- 2006.- Режим доступа: http: //www.bsu.ru/content/hecadem/bahanova_mv/. Дата доступа: 12.03.2014.

21. Олескин, А. В. Надорганизменный уровень взаимодействия в микробных популяциях [Текст] /А. В. Олескин // Микробиология.- 1993.- Т.62.- С.389-403.

22. Олескин, А. В. Политический потенциал современной биологии [Текст] / А. В. Олескин // Вестн. Росс. Акад. Наук. - 1999. - С.35-41.

23. Преч, Э. Определение строения органических соединений [Текст] / Э.Преч, Ф.Бюльманн, К.Аффольтер // М.: Мир, 2006. − 439с.

24. Пигменты/ Пигменты бактерий и грибов [Электронный ресурс].- 2009.-Режим доступа: http: //micro.moy.su/publ/pigmenty_bakterij. Дата доступа: 18.02.14.

25. Система гормональной регуляции/ Виды, пути и механизмы действия гормонов Гормоны [Электронный ресурс].- 2009.- Режим доступа: http: //andarcome.moy.su/news/sistema_gormonalnoj_reguljacii/. Дата доступа: 12.03.2014.

26. Стволовые клетки/ Подавление аутоиндукторов [Электронный ресурс].- 2001.- Режим доступа: http: //reftrend.ru/346242.html. Дата доступа: 23.02.2015.

27. Ames, B. N. An improved bacterial test system for defection and classification of mutagens and carcinogens [Text] / B. N. Ames, F. D. Lee, W. E. Durston // Procl. Nac. Akad. Sci.- USA.- 1973.- V.70, N3.- P. 782.

28. Bakkiyaraj, D.Inhibition of quorum sensing regulated biofilm formation in Serratia marcescens causing nosocomial infections [Text] / D. Bakkiyaraj, C. Sivasankar, S.K. Pandian // Bioorg Med Chem Lett – 2012.-V.22.- P.3089-3094.

29. Bedmar, E. J.Detection, purification and characterisation of quorum-sensing signal molecules in plant-associated bacteria [Text] / E.J. Bedmar, G. Brelles-Marino // Biotechnol – 2001.- V.91.- P. 197-209.

30. Сarnes, E. C.Confinement-induced quorum sensing of individual Staphylococcus aureus bacteria [Text] / E.C. Carnes // Nature Chemical Biology – 2010. – V. 6.- P. 41-45.

31. Crone, S.A novel in vitro wound biofilm model used to evaluate low-frequency ultrasonic-assisted wound debridement [Text] / S. Crone, C. Garde, T. Bjarnsholt, M. Alhede // Microbiology – 2015.-V.10.-P.64-72.

32. Decho, A. W.Quorum sensing in natural environments: emerging views from microbial mats [Text] / A.W. Decho // Trends in Microbiology – 2010.-V. 18.-P. 73-80.

33. Fuqua, W. C. Quorum sensing in bacteria: the LuxR-LuxI family of cell density-responsive transcriptional regulators [Text] / W. C. Fuqua, S. C. Winans, E. P. Greenberg // J. Bacteriol. - 1994. - V.176. - N. 2. - P.269-275.

34. Fux, C.A. Survival strategies of infectious biofilms [Text] / C.A.Fux, J.W.Costerton, P.S.Stewart, P.Stoodley // Trends Microbiol.- 2005.- V.13.- P. 34–4

35. Gray, K. M. Intercellular communication and group behavior in bacteria [Text] / K. M. Gray // Trends Microbiol - 1997. - V.5. - N 5. - P.184-188.

36. Hentzer, M. Attenuation of Pseudomonas aeruginosa virulence by quorum sensing inhibitors [Text] / M. Hentzer, H. Wu, J.B. Andersen, K. Riedel, T.B. Rasmussen, N. Bagge, N. Kumar, M.A. Schembri, Z. Song, P. Kristoffersen, M. Manefield, J.W. Costerton, S. Molin, L. Eberl, P. Steinberg, S. Kjelleberg, N. Hoiby, M. Givskov // The EMBO J. – 2003. V. 22.- P. 3803-3815.

37. Hentzer, M. Pharmacological inhibition of quorum sensing for the treatment of chronic bacterial infections [Text] / M. Hentzer, M. Givskov // J. Clin. Invest – 2003. V.112.-P. 1300-1307.

38. Hirschfeld, J.Dynamic interactions of neutrophils and biofilms[Text] / J. Hirschfeld // Oral Microbiol -2014.-V.6.-P. 247-248.

39. Nadell, C.Extracellular matrix structure governs invasion resistance in bacterial biofilms [Text] / C. Nadell, K. Drescher, N. Wingreen, B. Bassler // Microbiology – 2015.- V. 1038.-P. 246-247.

40. Makris, C.Critical Population Density Triggers Rapid Formation of Vast Oceanic Fish Shoals [Text] / C. Makris, P. Ratilal, S.Jagannathan, Z.Gong, M. Andrews, I. Bertatos, O.Rune, R.Nero // Science – 2009. V.323.- P. 1734-1737.

41. Manefield, M. Halogenated furanones inhibit quorum sensing through accelerated LuxR turnover [Text] / M. Manefield, T.B. Rasmusen, M. Hentzer, J.B. Anderson, P. Steinberg, S. Kjelleberg, M. Givskov // Microbiology – 2002. V.148.- P.1119-1127.

42. Manefield, M. Evidence that halogenated furanones from Delisea pulchra inhibit acylated homoserine lactone (AHL)-mediated gene expression by displacing the AHL signal from its receptor protein [Text] / M. Manefield, R. de Nys, N. Kumar, R. Read, M. Givskov, P. Steinberg, S. Kjelleberg // Microbiology – 1999. V.145.-P. 283-291.

43. Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum [Text] / D. Martinelli, G. Grossmann, U. Sequin, H. Brandl, R. Bachofen // BMC Microbiology – 2004. No.4, V.25.

44. Maron D. M. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test [Text] / D. M. Maron, B. N. Ames //Mutat. Res.- N113.- 1983.- P.174-210.

45. Miller, M.Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. [Text] / M. Miller, B. Bassler // Microbiology – 2001. V.55.-P. 319-346.

46. Martinelli, D. Effects of natural and chemically synthesized furanones on quorum sensing in Chromobacterium violaceum [Text] / D. Martinelli, G. Grossmann, U. Sequin, H. Brandl, R. Bachofen // BMC Microbiology – 2004. No.4, V.25.

47. Novick, R.Autoinduction and signal transduction in the regulation of staphylococcal virulence. Mol. Microbiol [ Text] / R. Novick // Microbiology- 2003. V. 48.-P. 1429-1449.

48. Olsen, I. Biofilm-specific antibiotic tolerance and resistance [Text] / I. Olsen // Microbiol Infect – 2015.- V. 154.- P.317-318.

49. Rosemeyer, V. lux I- and luxR-homologous genes of Rhizobium etli CNPAF512 contribute to synthesis of autoinducer molecules and nodulation of Phaseolus vulgaris [Text] / V. Rosemeyer, J. Michiels, C. Verreth, J. Vanderleyden// J. Bacteriol. - 1998. - V.180. - N 4. - P.815-821.

50. Saygili, N. Synthesis of New 3-Pyrrolin-2-One Derivatives [Text] / N.Saygili, A.Altunbas, A.Yesilada, N.Saygili // Turk. J. Chem.- 2006.- V. 30.- P. 125-130.

51. Schineller, J. B.Transcriptional regulation of bioluminesence genes from Vibrio fischeri [Text] / J.B. Schineller, D.M. Sitnikov, T.O. Baldwin // Mol Microbiol – 1995.- V.17.- P. 801- 812.

52. Shapiro, J. A. The significances of bacterial colony patterns [Text] / J. A. Shapiro // BioEssays. - 1995. - V. 17. - N 7. - P. 597-607.

53. Sing, S. Furanone derivatives: diverse biological activities [Text] / S. Sing, P.K. Sharma, N. Kumar, R. Dudhe // An international journal of pharmaceutical sciences.- 2011.- P.1036-1046.

54. Tao, Y. The function of SpnR and the inhibitory effects by halogenated furanone on quorum sensing in Serratia marcescens AS-1 [Text] / Y. Tao, T. Morohoshi, N. Kato, T. Ikeda, H. Zhuang // Wei Sheng Wu – 2008.-V.48.- P. 391-397.

55. Townsley, L.Temperature affects c-di-GMP signaling and biofilm formation in Vibrio cholerae [Text] / L. Townsley, F.H. Yildiz // Environ Microbiol – 2015.-V. 10.-P. 343-345.

56. Weaver, L.Biofilm resilience to desiccation in groundwater aquifers: A laboratory and field study [Text] / L. Weaver, J. Webber, A. Hickson, P. Abraham, M. Close // Sci Total Environ – 2015.- V.514.-P. 281-289.

57. Waters, C.Quorum Sensing: cell-to-cell communication in bacteria. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. [Text] / Waters, C de B. Bassler // Microbiology – 2005. V.25.-P. 319-346.

⇐ Предыдущая 1 2 34
Поделиться:

Последнее изменение этой страницы: 2017-04-12; Просмотров: 467; Нарушение авторского права страницы