Методы обнаружения вируса в культуре клеток.

О наличии и размножения вируса в клетках узнают по так называемому цитопатическому эффекту: в результате размножения вируса клетки гибнут, и под микроскопом заметны дегенеративные изменения клеток. Пласты зараженных клеток отслаиваются от стенки пробирки или флакона. Так как рост клеток прекращается, pН среды мало изменяется по сравнению с контролем (клетки без вируса).

1. Развитие специфической дегенерации клеток – смотрят под микроскопом: образование многоядерных гигантских клеток, округление клеток, очаги клеточной пролиферации.

2. Обнаружение внутриклеточных включений – в цитоплазме или ядре (окрашивают и смотрят под микроскопом).

3. Обнаружение специфического Аг методом иммунофлюоресценции.

4. Положительная реакция гемадсорбции.

5. Положительная реакция гемагглютинации.

6. Образование бляшек – появляются обесцвеченные участки в культуре, состоящие из погибших клеток – это колонии вируса. Окрашивают красным красителем – бляшки круглые, светлые.

 

Цитопатический эффект, определение, классификация.

Цитопатическии эффект - дегенерация клеток, возникающая под действием размножающегося в культуре ткани вируса. Микроскопически цитопатическое действие, выражается в различных изменениях морфологии клеток, образовании гигантских многоядерных клеток (симпластов), пикнозе ядер и, наконец, в полной деструкции клеток. Макроскопически заметно слущивание клеток со стенок пробирки. Характер клеточной дегенерации зависит, в основном, от вида вируса.

12. Методы типирования вирусов:

Определение типа вирусов в вирусосодержащем материале основа­но на нейтрализации вируса типоспецифическими сыворотками. Конечный результат реакции может быть установлен на основании следующих признаков:

1)нейтрализация ЦПД;

2)нейтрализация реакции гемадсорбции;

3)цветная проба;

4)задержка (торможение) гемагглютинации;

5)свечение клеток, содержащих вирус, под влиянием типоспецифиаческих флуоресцирующих сывороток;

6)нейтрализация в опыте на животных.

Сущность реакции гемадсорбции.

Гемадсорбция - адсорбция эритроцитов на поверхности пораженных вирусом клеток.

Методика реакции. В пробирки о зараженной вирусом культурой ткани вносят 0, 2 мл 0, 4%-ной взвеси эритроцитов. Пробирки встряхивают и оставляют в наклонном положении. Длительность контакта эритроцитов с клетками зависит от температуры инкубация и вида вируса. Учет реакции производят под малым увеличением микроскопа после непродолжительного покачивания пробирки для отделения неадсорбированных эритроцитов от поверхности клеток. При вирусной гемадсорбции эритроциты прочно фиксированы на клетках и сохраняются на них после 1-2-кратного отмывания. Адсорбируясь на поверхности пораженных вирусом клеток, эритроциты образуют характерные скопления.

 

Сущность метода цветных проб.

Цветная реакция. В основу реакции положено то обстоятельство, что в процессе размножения и роста клеток в питательной среде накапливаются кислые продукты обмена веществ, снижающие рН среды. В ткани, зараженной вирусом, наступает дегенерация клеток, в силу чего подавляется их метаболизм и не происходит изме­нение рН среды. Для выявления этих изменений в питательную среду добавляют индикатор феноловый красный. При рН выше 7 цвет индикатора красный, при рН 7 - оранжевый и при рН ниже 7 - желтый.

Если клетки не заражены вирусом (или он нейтрализован специфической сывороткой), рH питательной среды сдвигается в кислую сторону, и она становится желтой. В случае размножения вируса клетки дегенерируют, и среда сохраняет исходный красный цвет.

Метод цветных проб может быть использован для титрования ви­руса или вируснейтрализирующих антител.

 

Сущность метода бляшек.

В основе метода лежит появление в монослое зараженных вирусом клеток обесцвеченных участков, состоящих из дегенерированных клеток. Эти участки, получившие название бляшек, представляют собой колонии вируса, образующегося из одной вирусной частицы.

Метод заключается в следующем. В специальном флаконе на стенке монослой клеток, затем удаляют питательную среду. Клетки заражаю вирусом и заливают агаром, содержащим индикатор нейтральный красный. Там, где происходит рост клеток, среда изменится в кислую сторону и индикатор окрасится в розовый цвет. На тех участках, где клетки погибли под действием вируса, рН среды и, следовательно, цвет индикатора не изменяется. Такие островки неокрашенной среды имеют вид беловатых бляшек.

 

Сущность реакции гемагглютинации дляобнаружения вирусов.

Реакция гемагглютинации. Аллантоисную жидкость проверяют на содержание вируса путем агглютинации куриных эритроцитов на стекле (и в пробирках - титрование вируса). Для постановки реакции на стекле к капле вируссодержащего материала добавляют одну каплю 5%-ной взвеси эритроцитов. Реакция проходит в течение 5 минут.

 

Методы микробиологической диагностики вирусных инфекций.

1.Вирусоскопический - обнаружение в исследуемом материале с помощью методов электронной микроскопии вирионов или с помощью светооптических микроскопов внутриклеточных включений.

2.Обнаружение вирусов с помощью методов иммуноэлектронной микроскопии.

3.Вирусологические методы - выделение чистых культур вирусов с использованием культур клеток или куриных эмбрионов.

4.Серологические методы - обнаружение противовирусных антител в сыворотке больного или реконвалесцента с помощью реакций нейтрализации вирусов, реакции связывания комплемента, реакции торможения гемагглютинации, реакций иммуноферментного метода (ИФМ), радиоиммунного метода, (РИМ), реакции пассивной гемагглютинации (РПГА), реакции гемагглютинации иммунного прилипания (комплекс АГ+АТ в присутствии комплемента адсорбируется на эритроцитах), реакций преципитации в агаре, имлунофлуоресцентного метода. В принципе эти реакции могут быть использованы и для обнаружения вирусных ан­тигенов.

5.Биологические методы - заражение чувствительных к данному вирусу лабораторных животных с целью воспроизведения заболевания или последующего выделения вируса.

Что такое вирусоскопический метод диагностики.

Материал со слизистой носа, зева эмульгируют в физиологическом растворе, осаждают и из осадка готовят мазки.

Мазки после высушивания обрабатывают типоспецифическими люминесцирущими сыворотками и микроскопируют с помощью люминесцентно­го микроскопа. Клетки, содержащие соответствующий вирус, адсорби­руют специфические люминесцирующие антитела и светятся.

 

Что такое вирусологический метод диагностики.

Заражение куриных эмбрионов в аллантоисную или амниотическую полости. Вирус обнаруживают путем реакции гемаг-глютинации, типируют с помощью РТГА Заражение культуры ткани. В культуре ткани вирус обнаруживают по цитопатическому эффекту, по изменению цвета среды и по реакции гамадсорбции; типируют по РТГА, нейтрализации ЦПЭ и реакции гемадсорбции. Заражение белых мышей. Типируют вирус мотодом нейтрализации со специфическими сыворотками.

 

Типы вирусных инфекций.

1.Вирусы с непродолжит пребыванием вируса в организие

-острая; -бессимптомная; -абортативная инфекция

2. Вирусы с продолжит пребывание вируса в организме

-латентные; -Хронические; -медленные

 

Особенности и механизмы противовирусного иммунитета.

1. Активность Т-цитотоксических лимфоцитов(Т-киллеров) и др киллерных клеток

2. Активность системы интерферона

3. Образование вируснейтрализирующих систем

 

Механизмы персистирования вирусов в организме.

1. Вирус находится в дефектном состоянии, он не способен размножаться и индуцировать эффект иммунного ответа

2. вирус находится в клетке в виде свободной геномной нукл к-ты, не достает действия антител

3. Геном вируса интегрирован в хромосому клетки-мишени (вирогения)

 

⇐ Предыдущая1234Следующая ⇒

Поделиться: