Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами. Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с "порами", через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества. В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной "пор".

Неподвижная фаза - жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул .

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).

Ультрацентрифугирование

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги. При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой .После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

 

Разделение смеси белков методом гель-фильтрации.

 

Кювета, заполненная буферным раствором с разделёнными белковыми фракциями.

Электрофорез белков

Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки - к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α₁ глобулины, α₂ -глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57). Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным). Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

 

2. Назовите три-четыре сходства ферментов c небиологическими катализаторами.

 Ферменты и небиологические катализаторы, подчиняясь общим законам катализа, имеют следующие сходные признаки.

1. Они катализируют только энергетически возможные реакции.

2. Они никогда не изменяют направления реакции.

3. Они не изменяют равновесия обратимой реакции, а лишь ускоряют его наступление.

4. Они не расходуются в процессе реакции. Поэтому фермент в клетке работает до тех пор, пока по каким - либо причинам не разрушится.

Однако ферменты обладают и особыми качествами, отличающими их от небиологических катализаторов. Эти отличия связаны с особенностями строения ферментов, являющихся сложными белковыми молекулами.

1. Скорость ферментативного катализа намного выше, чем небиологического. Из этого следует, что ферменты сильнее снижают энергию активации реакции, чем небиологические катализаторы.

2. Ферменты обладают высокой специфичностью. Есть ферменты, действующие только на один из стереоизомеров вещества, тогда как платина, например, используется в качестве катализатора при самых разнообразных реакциях. Высокая специфичность позволяет ферментам направлять обмен веществ в строгое русло.

3. Ферменты катализируют химические реакции в « мягких» условиях, т.е. при обычном давлении, невысокой температуре ( около 37^оС) и рН среды, близком к нейтральной. Это отличает их от других катализаторов, действующих при больших давлениях, крайних значениях рН и высокой температуре.

Ферменты из-за белкового строения весьма чувствительны к изменениям температуры, т.е. термолабильны, и к сдвигам рН среды.

4. Ферменты являются катализаторами с регулируемой активностью, чего нельзя сказать о небиологических катализаторах. Это уникальное свойство ферментов позволяет изменять скорость превращения веществ в организме в зависимости от условий среды, т.е. приспосабливаться к действию различных факторов.

5. Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству фермента, тогда как для небиологического катализа не существует строгой зависимости скорости реакции от количества катализатора. Поэтому недостаток фермента в живом организме означает низкую скорость превращения вещества и , наоборот, одним из путей приспособления клеток организма является образование дополнительных количеств фермента.

 

3. Приведите три-четыре примера коферментов.

ТИАМИНОВЫЕ в составе витамин В1 (ТИАМИН) - ТМФ – ТИАМИНМОНОФОСФАТ, ТДФ- ТИАМИНДИФОСФАТ, ТТФ - ТИАМИНТРИФОСФАТ. ТПФ связана с ферментами ДЕКАРБОКСИЛАЗАМИ альфа КЕТОКИСЛОТ (ПВК, альфа КГК)

 

2.ФЛАВИНОВЫЕ содержат витамин В2 - ФМН – ФЛАВИНМОНОНУКЛЕОТИД, ФАД - ФЛАВИИАДЕНИНДИНУКЛЕОТИД.

ФМН и ФАД связанны с ферментами ДЕГИДРОГЕНАЗАМИ. Участвуют в реакциях ДЕГИДРИРОВАНИЯ.

3. ПАНТОТЕИНОВЫЕ (витамин ВЗ) - KOF A (HS-KOA - HS КОЭНЗИМ А) - КОФЕРМЕНТ АЦИЛИРОВАНИЯ.

4. НИКОТИНАМИДНЫЕ содержат витамин РР (НИАЦИН)- НАД (НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИД), НАДФ (НИКОТИНАМИДАДЕНИНДИНУКЛЕОТИДФОСФАТ). Связаны с ДЕГИДРОГЕНАЗАМИ:

 

4. Назовите три основных проявления дефицита витамина PP (три «Д»). пожилой возраст; регулярное соблюдение строгого диетического питания; чрезмерное употребление спиртных напитков и наркотических веществ.
5. Назовите четыре нуклеотида, необходимых для синтеза ДНК. Аденин,тимин,цитозин,гуанин

6. Назовите основную функцию ДНК полимеразы. Задача ДНК-полимеразов с биологической точки зрения заключена в синтезе ДНК и касается его катализа. Фактически общие ДНК полимераза параметры данных ферментов одинаковые. Но все же конкретный образец ДНК полимераза характерный своими отличительными свойствами. Последние завязаны на определенной биологической функции. Она должна реализовываться благодаря структурным строениям. Ученые выделяют весьма немалую цифру ДНК-полимераз. Касательно человеческих клеток удалось идентифицировать репликативные полимеразы, ДНК-полимераза бета и гамма. ДНК полимераза и её идентификация помогла открыть в некоторых специфических человеческих клетках так называемые транскриптазы, которые впоследствии назвали обратными. На сегодня роль днк полимераза остается неизвестной. Кроме того удалось значительно скрупулезнее изучить и иной фермент – дезоксинуклеотидилтрансферазу. Ее функции, по убеждению исследователей, завязаны на синтезе антител.

7. Напишите реакцию катализируемую каталазой. Каталаза, гемсодержащий фермент, присутствует в пероксисомах всех клеток человека и обладает чрезвычайно высокой молекулярной активностью. В эритроцитах она находится в цитозоле и защищает гемоглобин от окисления.

⇐ Предыдущая1234567Следующая ⇒

Поделиться: