Метацеркарии трематод непатогенных для млекопитающих

Методические указания

по определению возбудителей гельминтозоонозов

у пресноводных рыб Беларуси

Минск – 2007 г.

Общие положения

1.1. Гельминтозоонозы - группа паразитарных болезней, возбудители которых в личиночной стадии регистрируются у различных видов рыб, а в половозрелой - у человека и животных.

1.2. Возбудители гельминтозоонозов проходят сложный цикл развития с участием промежуточных (моллюски, циклопы, диаптомусы и олигохеты), дополнительных (пресноводные рыбы) и окончательных (человек, кошка, собака, дикий кабан, волк, лисица, выдра и др.) хозяев.

1.3. Личиночные стадии возбудителей гельминтозоонозов по отношению к дополнительным хозяевам имеют определенную приуроченность и характерные места локализации (приложение №1).

1.4. У пресноводной рыбы из водоёмов, находящихся на территории Республики Беларусь, регистрировались возбудители описторхоза, меторхоза, псевдамфистомоза, эхинохазмоза, россикотремоза, апофаллоза, дифиллоботриоза. Другие возбудители гельминтозоонозов, указанные в приложениях к методике, выявлялись у рыбы из водоемов, находящихся на территориях сопредельных с Республикой Беларусь стран.

Ход исследования рыбы

2.1. Для исследования отбирают по 15 экземпляров живых или свежеуснувших рыб определенного вида, с указанием даты исследования, вида рыбы и места вылова.

2.2. Рыбу взвешивают, измеряют длину тела от вершины рыла до начала лучей хвостового плавника. Визуально осматривают плавники, чешую, жабры. Измененные участки тела просматривают дополнительно под лупой и микроскопом. Ножницами разрезают брюшко по средней линии от анального отверстия до области сердца. С помощью лупы просматривают сердце, гонады, печень, селезенку, почки, стенки желудка, кишечник, серозные покровы. Каждый орган отдельно помещают в чашки Петри или на часовые стекла. Из органов и тканей нарезают полоски длиной до 10 мм и толщиной 3-4 мм, помещают в компрессорий или между стеклами 9х12 см и микроскопируют. Мышцы осматривают, разрезая на продольные и поперечные полоски, и исследуют с помощью микроскопа.

2.3. В мускулатуре и во внутренних органах рыб встречаются метацеркарии трематод, патогенные и непатогенные для человека и животных. В полости тела, икре, внутренних органах, мышцах рыб (щуки, налима, судака, окуня, ерша и др.) могут обнаруживаться плероцеркоиды цестод. Для непатогенных человеку и животным метацеркариев трематод и плероцеркоидов дефинитивными хозяевами являются рыбоядные птицы (чайки, цапли) или хищные рыбы (щука). Для дифференциации этих личинок гельминтов у рыб пользуются таблицей (приложение №2).

2.4. Извлечение метацеркариев. Цисту, извлечённую из тканей рыб, помещают в каплю физиологического раствора, под контролем микроскопа препаровальными иглами освобождают от наружной оболочки. При легком надавливании иглой на покровное стекло, под которое помещают препарат, внутренняя оболочка разрывается. Наличие движений у личинки указывает на ее жизнеспособность.

2.5. Для патогенных человеку и животным метацеркариев трематод из сем. Opisthorchidae (описторхисы, меторхисы, псевдамфистомы, клонорхисы) при осмотре под микроскопом характерно наличие двух круглых, одинакового размера присосок, которые окрашены светлее тела личинки, и черного экскреторного пузыря овальной или грушевидной формы, занимающего 1/3-1/4 тела личинки (рис. 2, 4). Для живых личинок характерно активное движение тела в цисте. Форма тела освобожденных из цист личинок сходна с таковой у половозрелых форм (см. рис.1 приложения 3).

2.6. Из непатогенных человеку и животным метацеркариев трематод близкое строение к описторхидам имеют личинки из рода буцефалюс и рипидокотиле, для которых характерно наличие одной крупной ротовой присоски чашеобразной формы с пальцеобразными выступами, экскреторного пузыря зигзагообразной формы, занимающего 2/3 тела личинки (рис. 7, 8) и слабая подвижность.

2.7. Для метацеркариев параценогонимусов характерна большая чёрная экскреторная система с тремя белыми щелевидными пространствами (рис. 12).

2.8. Плероцеркоиды лентеца широкого (Diphylobothrium latum) встречаются обычно без капсул. Длина живых плероцеркоидов от 1 мм до 2,5 см и более. Личинки беловато-молочного цвета. Характерно наличие на теле личинок глубоких складок (ложная сегментация), которые сохраняются даже после расслабления в воде. Сколекс у плероцерокоидов, только что извлечённых из рыбы, обычно втянут (инвагирован), и личинка имеет булавовидную форму, но при помещении её в тёплую воду сколекс вскоре вытягивается (при этом становятся хорошо заметны и присасывательные щели) и перистальтически сокращается. Личинка активно движется, то сокращаясь, то сильно вытягиваясь. Сколекс при этом приобретает вид удлинённого, заостренного на конце конуса.

2.9. Другие личинки, встречающиеся у рыб, определяют, пользуясь таблицей 2.

3. Определение жизнеспособности личинок цестод и трематод.

3.1. Извлеченных из органов и тканей рыбы (из цист) плероцеркоидов помещают в подогретый (до 40°С) физиологический раствор или в искусственный желудочный сок (100 мл 0,5%-ного раствора поваренной соли, 0,5 г пепсина, 0,75 мл 35%-ного раствора соляной кислоты). Под лупой осторожно раздражают личинку препаровалъной иглой. Наличие даже слабых движений указывает на жизнеспособность плероцеркоида.

3.2.1. Личинок трематод, выделенных из органов рыб, освобождают от остатков ткани под контролем лупы. На препарат наносят 2 капли 3%-ного раствора розоловой кислоты на 70%-ном спирте на 2 минуты, добавляют каплю 0,1%-ного раствора едкого калия, оставляют на 2 минуты. Излишек краски смывают физиологическим раствором, препарат высушивают полоской фильтровальной бумаги, накрывают покровным стеклом и просматривают под микроскопом. Мышечная ткань и мертвые личинки окрашиваются в розовый цвет, живые личинки не окрашиваются.

3.2.2. Жизнеспособность личинок трематод можно определять, используя микроскоп с подогревательным столиком. Выделенных паразитов переносят на столик (при 36-37°С), добавляют 2-3 капли желчи или 0,5%-ного раствора трипсина. Живые личинки через 5-10 минут выходят из цист.

4. Определение видовой принадлежности метацеркариев.

4.1. В сомнительных случаях, если не удается сразу установить вид метацеркариев трематод, обнаруженных в пробе, рекомендуется произвести освобождение личинок от оболочек механически (п. 2.4.) или химическим способом (п. 3.2.1. и п. 3.2.2.).

4.2. Измельченные кусочки поверхностного слоя поверхностных мышц (0,3 х 0,5 см) в количестве 10-15 г помещают в искусственный желудочный сок в соотношении 1:10. Выдерживают в термостате при 37-40°С 2-3 часа, процеживают через марлю. Осадок переносят в чашку Петри, цисты вылавливают пипеткой при проходящем свете под лупой или под микроскопом, или, добавив физиологический раствор, круговыми движениями
чашки отмывают, при этом цисты концентрируются в центре чашки. Раствор с края осторожно удаляют резиновой грушей. Промывку повторяют до полного удаления остатков не переваренной мышечной ткани. Для освобождения от внутренней оболочки цисты помещают в теплый (22-24°С) раствор трипсина и поваренной соли (на 100 мл
1%-ного раствора поваренной соли берут 1 г трипсина).

4.3. Личинки гельминтов, освобожденные от оболочек, имеют характерные признаки, по которым их можно отнести к определенному виду. Определяют видовую принадлежность личинок, используя приложение 2.

5. Меры профилактики
5.1. При работе с патологическим материалом необходимо соблюдать меры личной профилактики. По окончании исследования следует тщательно мыть руки с мылом и щеткой, а место работы обрабатывают 2%-ным раствором кальцинированной соды.

5.2. Выловленная из водоема рыба, у которой обнаружены возбудители гельминтозоонозов, считается условно годной и подлежит переработке в соответствии с «Инструкцией по санитарно-гельминтологической оценке рыбы, зараженной личинками дифиллоботриид (возбудителями дифиллоботриозов) и личинками описторхиса (возбудителем описторхоза) и ее технологической обработке», утв. ГУВ Минсельхозпрода РБ 16.10.2007г. №.10-1-5/

С утверждением настоящих Методических указаний утрачивает силу «Методика определения возбудителей гельминтозоонозов в пресноводных рыбах», утв. ГУВ МСХ СССР от 21.03.83 г, № 115 – 6 а.

Приложение №1 к «Методике определения

возбудителей гельминтозоонозов

у пресноводных рыб Беларуси»

Таблица 1. Видовое разнообразие возбудителей гельминтозоонозов, передающихся от рыб, с указанием видов восприимчивых рыб и мест локализации личинок

Вид паразита	Поражаемые виды рыб	Наиболее частые места локализации личинок
Opisthorchis felineus, Metorchis albidus, Pseudamphistomum truncatum	В наибольшей степени язь. елец, линь, меньше - плотва, усач, лещ, густера, жерех, пескарь, сазан, красноперка, уклея, сырть, подуст, гольян, вобла, овсянка и др.	Поверхностный слой мышц на глубине 2-3,4 мм (в небольшом количестве обнаруживаются во внутренних органах, жабрах, стенках кишечника, на чешуе).
Rossicotrema donicum	Окунь, ерш, судак	Плавники, поверхность кожи
Apophallus muhlingi	Елец, голавль, язь, гольян, плотва, уклея, лещ, густера и др.	Плавники, жабры
Echinochasmus perfoliatiis	Щука, линь, сазан, лещ, язь, густера, вобла, красноперка, плотва, тарань, жерех, белоглазка, синец, карась, уклея, окунь, судак, ерш, вьюн, сом, карп	Жаберные лепестки
Clonorchis sinensis	Сазан, черный и белый амур, толстолобик, верхогляд, карась, окуневые, бычковые и др.	Поверхностный слой мышц на глубине 2-3,4 мм (в небольшом количестве обнаруживаются во внутренних органах, жабрах, стенках кишечника, на чешуе).
Metagonimus yokogawai	Преимущественно карповые	Плавники, поверхность кожи
Nanophyetes schikchobalowi	Ленок, таймень, амурский сиг, кета, горбуша; амурский хариус	Мышцы плавников, сердце, почки, реже -мышцы тела, головы, жабры
Diphyllobotrium latum	Щука, окунь, ерш, налим	Икра, молоки, печень, серозные покровы, мышцы (без цист)
D.dendriticum	Хариус, омуль, сиг, корюшка, окунь, ряпушка, голец, муксун, форель	Мышечная ткань, молоки, икра, печень, серозные покровы (инцистируются)
Dioctophyme renale	Язь, плотва, щука, шемая, лопатонос, усач,	Стенки кишечника, мышечная ткань (в виде цист)

Таблица 2. Видовое разнообразие встречающихся у рыб

возбудителей гельминтозов не опасных для млекопитающих

Вид паразита	Поражаемые виды рыб	Наиболее частые места локализации личинок