Строение светового микроскопа

Занятие №1

Методы клеточной биологии

I. Световая микроскопия

Световой микроскоп

Микроскоп (от лат. micros — малый и scopein — рассматривать, наблюдать) — прибор, позволяющий получать увеличенное изображение объектов и структур, недоступных глазу человека. Изобретение микроскопа обусловлено скачком в развитии оптики в XVI-XVII вв. Некоторые оптические свойства изогнутых поверхностей были известны еще Евклиду (300 лет до н.э.) и Птоломею (127-151 гг.), однако их увеличительная способность не нашла практического применения. Первые очки были изобретены Сальвинио дели Арлеати в Италии только в 1285г. В XVI веке Леонардо да Винчи и Мауролико показали, что малые объекты лучше изучать с помощью лупы. Тогда же в Нидерландах потомственные оптики Захарий и Ханс Янсены (1590г.) смонтировали две выпуклые линзы внутри одной трубки, т. е. фактически создав первый микроскоп и заложив основы для создания сложных микроскопов.

Простые микроскопы появились в XVII в. Больших успехов в их изготовлении добился голландский ученый А. Левенгук. 1683 год можно считать годом рождения науки о микроорганизмах - микробиологии. В этом году в голландском городе Делфте Антони ван Левенгук впервые увидел бактерии, о чем сообщил письмом в самое авторитетное научное учреждение того времени - Лондонское королевское общество.

В 1609—1610 гг. сложный микроскоп был построен Г. Галилеем (1564—1642). В 1846г. немецкий механик Карл Цейсс (1816—1888) открыл мастерскую и через год приступил к изготовлению микроскопов. Карл Цейсс успешно использовал в деятельности своей фирмы ZEISS открытия профессора физики Эрнста Аббе, который впоследствии становится его полноправным компаньоном. Теоретические и практические работы Эрнста Аббе (1840—1905), Отто Шотта (1851 — 1935) и Августа Келера (1866—1948) определили направление развития и принципы построения оптических систем современных микроскопов.

Строение светового микроскопа

 Современный микроскоп состоит из следующих конструктивно-технологических частей: оптической, механической и осветительной.

 

Механическая часть микроскопа

Основным конструктивно-механическим блоком микроскопа является штатив . Штатив включает в себя основание и тубусодержатель. Основание представляет собой блок, на котором крепится весь микроскоп. В простых микроскопах на основание устанавливают осветительные зеркала или накладные осветители. В более сложных моделях осветительная система встроена в основание с блоком питания или без него. Тубусодержатель представляет собой блок, на котором закрепляются следующие части:

1. Узел смены объективов, имеющий следующие варианты исполнения — револьверное устройство, резьбовое устройство для ввинчивания объектива, «салазки» для безрезьбового крепления объективов с помощью специальных направляющих. Револьверное устройство обеспечивает точную установку микрообъективов в совмещенном оптическом тракте между осветительной и наблюдательной системами микроскопа. Смена объективов производится вращением рифленого кольца револьверного устройства до фиксированного положения.

 

2. Фокусировочный механизм грубой и точной настройки микроскопа на резкость — механизм фокусировочного перемещения объективов или столиков. Фокусировочный механизмявляется одним из важнейших узлов современного микроскопа. От качества его исполнения зависит точность и воспроизводимость фокусировки микроскопа на объект. Механизм расположен в штативе микроскопа и обеспечивает вертикальное перемещение предметного столика, который закреплен винтом в специальном кронштейне. Рукоятки расположены на одной оси и выведены с обеих сторон корпуса тубусодержателя. Грубое перемещение кронштейна с предметным столиком осуществляется рукоятками большего диаметра, точное перемещение – рукоятками меньшего диаметра. Общая величина грубой фокусировки составляет не менее 30 мм. Общая величина точной фокусировки - не менее 2.5 мм.

 

3. Узел крепления сменных предметных столиков. Предметный столик предназначен для крепления или фиксации в определенном положении объекта наблюдения. Столики бывают неподвижные, координатные и вращающиеся (центрируемые и нецентрируемые).

 

4. Узел крепления, а также фокусировочного и центрировочного перемещения конденсора. Конденсорное устройство устанавливается в специальный кронштейн и в фиксированное положение и закрепляется стопорным винтом. В конструкции кронштейна предусмотрены специальные юстировочные винты, предназначенные для перемещения конденсорного устройства в плоскости, перпендикулярной оптической оси микроскопа, при его центрировке. В конструкции микроскопа предусмотрен механизм перемещения конденсора вдоль оптической оси прибора для обеспечения оптимальной фокусировки осветительных лучей. К кронштейну конденсорного устройства снизу закреплена винтом специальная откидная оправа, предназначенная для установки сменных светофильтров.

 

5. Узел крепления сменных насадок (визуальных, фотографических, телевизионных, различных передающих устройств). Так, например, б инокулярная насадка, служащая для организации визуального наблюдения на микроскопе, устанавливается в гнездо насадок тубусодержателя и закрепляется специальным винтом. Посредством разворота окулярных трубок относительно оси шарнира имеется возможность установки требуемого расстояния между осями окулярных трубок от 56 до 72 мм в соответствии с глазной базой конкретного исследователя. Левая окулярная трубка может быть снабжена механизмом перемещения окуляров в пределах ± 5 дптр. для компенсации ошибки глаза исследователя.

 

Оптическая часть микроскопа

Основными оптическими элементами микроскопа являются оптические элементы, образующие осветительную (в том числе, конденсор), наблюдательную (окуляры) и воспроизводящую (в том числе объективы) системы микроскопа.

 

ОБЪЕКТИВЫ

Объективы микроскопа представляют собой оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения в плоскости изображения с соответствующим увеличением, разрешением элементов, точностью воспроизведения по форме и цвету объекта исследования. Они имеют сложную оптико-механическую конструкцию, которая включает несколько одиночных линз и компонентов, склеенных из 2-х или 3-х линз. Количество линз обусловлено кругом решаемых объективом задач. Чем выше качество изображения, даваемое объективом, тем сложнее его оптическая схема. Общее число линз в сложном объективе может доходить до 14. Объектив состоит из фронтальной и последующей частей. Фронтальная линза (или система линз) обращена к препарату и является основной при построении изображения соответствующего качества, определяет рабочее расстояние и числовую апертуру объектива. Последующая часть в сочетании с фронтальной обеспечивает требуемое увеличение, фокусное расстояние и качество изображения, а также определяет высоту объектива и длину тубуса микроскопа.

Маркировка объективов. Данные о каждом объективе маркируются на его корпусе с указанием следующих параметров:

· увеличение («х»-крат, раз): 8х, 40х, 90х;

· числовая апертура: 0, 20; 0, 65, пример: 40/0, 65 или 40х/0, 65;

· дополнительная буквенная маркировка, если объектив используется при различных методах исследования и контрастирования: фазовый — Ф (Рп2 — цифра соответствует маркировке на специальном конденсоре или вкладыше), люминесцентный — Л (L), и т.п. пример: 40х/0, 65 Ф или Ph2 40x/0, 65;

· длина тубуса (160 или  — «бесконечность») и через косую черту указывается толщина покровного стекла (0, 17; 0 или «—», последнее указывается, если объектив работает как с покровным, так и без покровного стекла), пример: 40х/0, 65 Ф; 160/0, 17 или Ph2 40x/0, 65;  /-;

· тип иммерсии с обязательной маркировкой цветным кольцом, расположенным ближе к фронтальному компоненту — МИ (oil) — черное кольцо, ВИ (W) — белое кольцо, ГИ (Glyc) — оранжевое кольцо;

· фирма-изготовитель, заводской номер или децимальный номер по каталогу.

ОКУЛЯРЫ

Окуляры представляют собой оптические системы, предназначенные для построения микроскопического изображения на сетчатке глаза наблюдателя. В общем виде окуляры состоят из двух групп линз: глазной — ближайшей к глазу наблюдателя — и полевой — ближайшей к плоскости, в которой объектив строит изображение рассматриваемого объекта. Современная маркировка окуляров предусматривает кроме указания линейного увеличения окуляра размер видимого поля изображения (линейное поле в мм): 10х/18. Маркировка наносится на фронтальную (переднюю) часть окуляра или по верхней образующей корпуса окуляра.

КОНДЕНСОР

Если освещаемый предмет находится на конечном расстоянии, то для его освещения используют конденсор. Оптическая система конденсора предназначена для увеличения количества света, поступающего в микроскоп. Конденсор располагается между объектом (предметным столиком) и осветителем (источником света). Часто конденсор является съемной частью и при настройке освещения имеет фокусировочное перемещение вдоль оптической оси и центрировочное перемещение, перпендикулярное оптической оси. При конденсоре может находиться осветительная апертурная ирисовая диафрагма. На фронтальной части конденсора наносится маркировка числовой апертуры (осветительной).

Фокусировка объектива

1.Предварительное исследование объекта всегда следует производить при малом увеличении. При работе с малым увеличением используется только макровинт, при помощи которого и двигают тубус, пока объект не окажется в фокусе.

2.Фокусировка при работе с сильными объективами (40х, 90х) проводится только после того, как закончено исследование на малом увеличении. Объект находится в поле зрения.

Для дальнейшей работы с иммерсионным объективом на объект капают капельку масла (не большую, но и не очень маленькую). Далее необходимо немного приподнять тубус микроскопа несколько выше положения точки фокусировки и переставить на нужный объектив. Тубус необходимо приподнимать, что не повредить объективы при вращении. Затем, пользуясь макровинтом, опускают тубус микроскопа до появления объекта в фокусе (даже не очень четком). После этого необходимо работать исключительно микровинтом.

Внимание! Неверная фокусировка может привести к раздавливанию препарата и повреждению объектива или/и конденсора.

Методы световой микроскопии

Структуру препарата можно различить лишь тогда, когда разные его частицы по-разному поглощают или отражают свет либо отличаются одна от другой (или от окружающей среды) показателем преломления. Эти свойства обусловливают разницу амплитуд и фаз световых волн, прошедших через различные участки препарата, от чего, в свою очередь, зависит контрастность изображения. Поэтому методы наблюдения в микроскопии выбираются (и обеспечиваются конструктивно) в зависимости от характера и свойств изучаемых объектов.

v Метод светлого поля

Метод светлого поля в проходящем свете применяется при исследовании прозрачных препаратов, у которых различные участки структуры по-разному поглощают свет (тонкие окрашенные срезы животных и растительных тканей, тонкие шлифы минералов и другие). Пучок лучей из осветительной системы проходит препарат и объектив и дает равномерно освещенное поле в плоскости изображения. Поглощающие элементы структуры препарата частично поглощают и отклоняют падающий на них свет.

Метод косого освещения является разновидностью предыдущего, отличаясь тем, что свет на объект направляют под большим углом к направлению наблюдения. В ряде случаев это позволяет выявить «рельефность» объекта за счёт образования теней.

Метод светлого поля в отраженном свете применяется для наблюдения непрозрачных объектов, к примеру, травленых шлифов металлов и различных минералов. Освещение препарата производится сверху, через объектив, который одновременно выполняет и роль осветительной системы. Изображение, как и при проходящем свете, создается за счет того, что разные участки препарата неодинаково отклоняют падающий на них свет, а отраженные лучи имеют различную интенсивность.

v Метод темного поля в проходящем свете

Метод тёмного поля в проходящем свете применяется для получения изображений прозрачных неабсорбирующих объектов, невидимых при освещении по методу светлого поля.Свет от осветителя и зеркала направляется на препарат конденсором специальной конструкции — т. н. конденсором тёмного поля. По выходе из конденсора основная часть лучей света, не изменившая своего направления при прохождении через прозрачный препарат, образует пучок в виде полого конуса и не попадает в объектив (который находится внутри этого конуса). Изображение в микроскопе создаётся лишь небольшой частью лучей, рассеянных микрочастицами находящегося на предметном стекле препарата внутрь конуса и прошедшими через объектив. В поле зрения на тёмном фоне видны светлые изображения элементов структуры препарата, отличающихся от окружающей среды показателем преломления. У крупных частиц видны только светлые края, рассеивающие лучи света. При этом методе по виду изображения нельзя определить, прозрачны частицы или непрозрачны, больший или меньший показатель преломления они имеют по сравнению с окружающей средой.Настройка микроскопа аналогична для микроскопов с различными типами освещения любого производства. Метод исследования в темном поле впервые был предложен австрийскими учеными Р.Зигмонди и Р. Зидентопфом в 1903 г.

Наибольшее применение метод нашел для подсчета бактерий. Этот наиболее простой в реализации метод контрастирования. В темнопольном освещении объекты освещены световым кольцом, внутренний диаметр которого больше, чем диаметр поля зрения объектива. Таким образом, прозрачные объемные объекты освещены вследствие рассеяния светового потока, а фон препарата остается не подсвеченным (темным).

 

v Метод фазово-контрастной микроскопии

Метод фазового контраста служит для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К числу таких объектов относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Метод основан на том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Эти фазовые изменения, не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Другими словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Такое изображение называется фазово-контрастным.

Метод может быть реализован двумя способами:

1. расположением элементов с фазовым и световым кольцами внутри оптических систем объектива и конденсора, соответственно;

2. расположением этих элементов вне объектива и окуляра внутри самого микроскопа.

Первый способ реализуется с помощью фазово-контрастных устройств, содержащих фазовые объективы и специальный конденсор с набором световых колец (встроенных в конденсор или выполненных в виде вкладышей). Приобретаются отдельно от микроскопа.

Второй способ реализуется с помощью соответствующих колец, которые устанавливаются в плоскости апертурной диафрагмы конденсора и в вынесенную с помощью дополнительных линзовых элементов плоскость выходного зрачка объектива. При этом и конденсор, и объектив — обычные. Чаще всего этот способ реализуется в современных инвертированных микроскопах.

Фазовые объективы внутри имеют фазовый элемент (линза или пластина) с нанесенным кольцом, которое изменяет фазу и уменьшает амплитуду световой волны. Середина кольца в среднем составляет ¹/₂—²/₃ от диаметра выходного зрачка объектива при этом светопропуска-ние кольца — 10—30% в зависимости от типа фазового контраста.

Фазовый конденсор в плоскости апертурной диафрагмы имеет пластину с прозрачным световым кольцом. Размер светового кольца, вернее его изображение, подбирается таким образом, чтобы оно соответствовало (или даже было чуть меньше) размеру фазового кольца объектива.

 

В типичной для этого метода схеме (рис. на стр.9) в переднем фокусе конденсора 3 устанавливается апертурная диафрагма 2, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива 5, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка 6, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка может быть помещена и не в фокусе объектива (часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива), но в любом случае неотклонённые в препарате 4 лучи от осветителя 1, дающие изображение диафрагмы 2, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на l/4 (l — длина волны света).

В то же время лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо (штриховые линии), и не претерпевают дополнительного сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами оказывается близкой к 0 или l/2, и в результате интерференции света в плоскости изображения 4' препарата 4 они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод позволяет различать малые элементы структуры, чрезвычайно малоконтрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для подобных частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.

 

v Метод инвертированной световой микроскопии

Инвертированные микроскопы проходящего света представляют собой «перевернутую» конструкцию обычного микроскопа: осветитель проходящего света расположен над объектом и имеет большое рабочее расстояние, тем самым обеспечивается свободный доступ инструмента (манипулятора, палочки, пипетки) к препарату, который находится, например, в чашке Петри. Специальные объективы установлены в револьверное устройство под предметным столиком. Объективы имеют большое и сверхбольшое рабочее расстояние по сравнению с обычными объективами, так как рассчитаны на работу с «покровным» стеклом (от 0, 5 до 2, 5 мм, иногда до 5 мм), которым является дно посуды, а также на работу в достаточно большом слое питательной среды в таком же диапазоне.

 

v Метод флуоресцентной (люминесцентной) микроскопии

Освещение объектов светом, возбуждающим люминесценцию, производится сверху через опак-иллюминатор и объектив. Современные люминесцентные микроскопы обычно являются вариантом модульной конструкции основной серии биологического микроскопа. Люминесцентный микроскоп отличается от биологического (проходящего света) наличием осветителя падающего (отраженного) света и дополнительных узлов, связанных со светофильтрами. В качестве источника света для люминесцентного осветителя используются ртутные лампы. При работе в свете люминесценции необходимо пользоваться только специальными люминесцентными объективами и нелюминесцирующими иммерсионными жидкостями (водная иммерсия и нелюминесцирующее масло).

При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра. Первый из них помещают перед конденсором; он пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта, либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами. Второй светофильтр, установленный после объектива, пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет люминесценции. В люминесцентной микроскопии используют как освещение препаратов сверху (через объектив, который в этом случае служит и конденсором), так и снизу, через обычный конденсор. Наблюдение при освещении сверху иногда называют «люминесцентной микроскопией в отражённом свете» (этот термин условен — возбуждение свечения препарата не является простым отражением света); его часто сочетают с наблюдением по фазово-контрастному методу в проходящем свете.

Различают первичную флюоресценцию (собственной флюоресценцию, нередко проявляемой витаминами, многими пигментами, некоторыми жировыми веществами и антибиотиками, встречающимися в живых организмах, некоторыми продуктами нормального и патологического обмена) и вторичную, или наведенную (возникает в результате поглощения объектом лучистой энергии).

Флуорохромы — красители, не вызывающие сильной окраски объектов в обычном свете, но флуоресцирующие при облучении ультрафиолетовыми лучами. Из синтетических флюорохромов наилучшие результаты дают акридин оранжевый, корифосфин, примулин, родамин, FITC (ФИТЦ, флюоресцеинизотиоцианат), которые обычно применяют в виде слабых водных растворов.

 

v Метод иммунофлуоресценции

Иммуноцито- и иммуногистохимические методы позволяют локализовать и идентифицировать клеточные и тканевые антигены, основываясь на их связывании с антителам. Использование антител лежит в основе исследований самых разных молекулярных образований:

― структурных компонентов клетки,

― клеточных продуктов (гормонов, ферментов, иммуноглобулинов),

― рецепторов клеточной поверхности.

Для визуализации места связывания антигена с антителом используется целый ряд меток: флуоресцентные красители, ферментные метки, металлы, металлопротеины, радиоизотопы.

 Выделяют 2 метода иммунофлуоресценции.

1. Прямой метод. Визуализация тканевых антигенов производится непосредственной конъюгацией их с антителами известной антигенной специфичности. Этот метод появился первым и является низкочувствительным.

По методике специфические антитела метят флуоресцирующим красителем (например, акридиновым оранжевым), не меняющим их свойств, и «наносят» на препарат. Полученный препарат анализируют в люминисцентном микроскопе. При этом будут флуоресцировать только те участки препарата, которые содержат антиген. Исследуя с помощью иммунофлуорисценции образование комплекса " антиген-антитело", для метки антител используют краситель, меняющий флуоресцентные свойства при соединении антител с антигеном.

 

2. Непрямой метод. Чувствительность иммуногистохимического окрашивания была значительно повышена с развитием непрямого способа. В непрямом методе в качестве первых антител используют немеченые антитела к клеточным антигенам, а в качестве вторых – меченые флуорохромом антитела. В результате первые антитела соединяются с антигеном, а вторые – с первыми. Следует отметить, что при непрямом методе увеличивается чувствительность (усиливается окрашивание) и специфичность (способность связываться только с определенными антигенами) метода.

Типы антител:

v Моноклональные антитела. Получили свое название от того, что из одной клетки, производящей антитела к нужному антигену, получают целые колонии таких же клеток (моноклон). Клетки, которые производят одинаковые антитела к определенной опухоли, получают путём слияния опухолевых клеток из перевиваемых культур с B-лимфоцитами, продуцирующими антитела. Такие клетки назвали «гибридомами». Они представляют собой уникальные «фабрики», способные в неограниченном количестве производить моноклональные антитела.

Моноклональные антитела вырабатываются клонами плазматических клеток. Антитела определенного клона иммунохимически идентичны и реагируют со специфическим эпитопом антигена, против которого они образованы (рис. 5). Возможно, по причине экономии мышей принято использовать почти эксклюзивно для продукции моноклональных антител. После достижения иммунного ответа выделяют В-лимфоциты из селезенки и лимфатических узлов и соединяют их в специальных условиях с клетками несекретирующей мышиной миеломы. В то время как В-лимфоциты производят специфические антитела, клетки миеломы дают гибридные клетки (гибридомы), которые долго живут в культуральных условиях. Нереактивные В-клетки и клетки миеломы убирают и культивируют антителопродуцирующую гибридому, тестируя ее на желанную реактивность. Размножение можно проводить в культуре или трансплантацией гибридомы в брюшную полость сингенной мыши. Так можно получить большое и, по крайней мере теоретически, неограниченное количество моноклональных антител со специфическими характеристиками.

Таким образом, моноклональные антитела – это гомогенные антитела, продуцируемые гибридными клетками, в которых сочетаются способность синтеза специфических иммуноглобулинов одного изотипа с неограниченной пролиферацией. Методику получения таких гибридных клеток, иначе называемых гибридомами (hybridomas), разработали Дж. Колер и К. Мильштейн в 1975 г. В общих чертах она состоит в том, что лимфоциты иммунизированного животного, например, мыши, гибридизуются с культивируемыми в среде опухолевыми клетками, в данном примере — мышиными миелобластами; в процессе пассажей гибридом удается проводить отбор клонов, синтезирующих антитела с интересующей исследователя специфичностью. Главным преимуществом моноклональных антител является именно стандартная и воспроизводимая в пассажах специфичность в отношении конкретного эпитотипа (химическая структура на поверхности сложно построенного антигена; в силу особенности своей конфигурации способна взаимодействовать с комплиментарной ей структурой в составе антитела (паратопом), определяя тем самым специфичность данной серологической реакции).

Изобретение технологии получения МКА было отмечено в 1980 году Нобелевской премией. Оно, прежде всего, явилось мощным инструментом для научных исследований в области биологии, иммунологии и медицины и открыло широкие перспективы для создания новых диагностических и лечебных средств в онкологии. К настоящему времени получено громадное количество гибридом-продуцентов моноклональных антител к различным, в том числе к опухоле-ассоциированным антигенам.

v Поликлональные антитела продуцируются различными клетками, и как следствие, иммуннохимически разнородны. Они реагируют с разнообразными эпитопами антигена, против которого они продуцированы. Наиболее часто используемое животное для получения поликлональных антител - кролик, далее следует козел, свинья, овца, лошадь, морская свинка и другие животные. В зависимости от иммуногенности антигена дозы от 10 до 200 мг часто употребляются для индукции иммунного ответа у животных. Антиген часто вводят внутри- или подкожно, однако также часто используют внутримышечные инъекции или инъекции в перитонеальную полость. У кроликов небольшие объемы (0, 1-0, 5 мл) обычно вводят внутрикожно; антиген разведен или суспензирован в равном объеме адъюванта, например таком как полный или не полный адъювант Фрэйда. Вспомогательную дозу постоянно раз в месяц или при уменьшении титра, увеличивает или поддерживает уровень антител. Кровь добывается из уха у кроликов, яремной вены (у больших животных) или из сердца, часто убийством животного. После удаления клеток, поликлональные антитела могут быть получены или в форме цельной стабилизированной антисыворотки, или разделено на фракции различной степени отчистки. Осаждение солями, после которой используется ионообменная хроматография, способствует удалению большей части других сывороточных протеинов. Афинная хроматография может быть использована для изотипии антигенспецифических антител и отделения их от перекрестнореагирующих антител к другим видам, особенно иммуноглобулинов человека.

v Метод поляризационной микроскопии.

См. учебник.

 

v Метод конфокальной микроскопии.

Конфокальный микроскоп впервые был сконструирован в 1957г. Конфокальный микроскоп дает две неоценимые возможности - исследование тканей на клеточном уровне в состоянии физиологической жизнедеятельности и демонстрации результатов исследования (т.е. клеточной активности) в четырех измерениях - высота, ширина, глубина и время. Использование микроскопа дает возможность получения “оптических срезов” толстых полупрозрачных объектов без их препарирования.

v Метод наблюдения в УФ-лучах.

Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа, т. е. понизить его предельное разрешение, которое зависит (см. выше) от длины волны λ применяемого излучения (для используемых в микроскопии УФ лучей λ = 400—250 нм, тогда как для видимого света λ = 700—400 нм). Но главным образом этот метод расширяет возможности микроскопических исследований за счёт того, что частицы многих веществ, прозрачные в видимом свете, сильно поглощают УФ излучение определённых длин волн и, следовательно, легко различимы в УФ изображениях. Характерными спектрами поглощения в УФ области обладает, например, ряд веществ, содержащихся в растительных и животных клетках (пуриновые основания, пиримидиновые основания, большинство витаминов, ароматические аминокислоты, некоторые липиды, тироксин и др.); это обусловило широкое применение УФ микроскопии в качестве одного из методов цитохимического анализа. Ультрафиолетовые лучи невидимы для человеческого глаза. Поэтому изображения в УФ микроскопии регистрируют либо фотографически, либо с помощью электронно-оптического преобразователя или люминесцирующего экрана. Распространён следующий способ цветового представления таких изображений. Препарат фотографируется в трёх длинах волн УФ области спектра; каждый из полученных негативов освещается видимым светом определённого цвета (например, синим, зелёным и красным), и все они одновременно проектируются на один экран. В результате на экране создаётся цветное изображение объекта в условных цветах, зависящих от поглощающей способности препарата в ультрафиолете.

v Метод наблюдения в ИК-лучах.

Метод наблюдения в инфракрасных (ИК) лучах также требует преобразования невидимого для глаза изображения в видимое путём его фотографирования или с помощью электронно-оптического преобразователя. ИК микроскопия позволяет изучать внутреннюю структуру объектов, непрозрачных в видимом свете, например тёмных стекол, некоторых кристаллов и минералов и пр.

v Методы обработки изображения.

Современное развитие науки и техники предусматривает применение современных методов обработки изображения и документирования с элементами сбора, систематизации и анализа информации. К таким приборам относятся анализаторы изображения, получившие свое развитие с конца 80-х годов ХХ-го века. Базовым микроскопом может служить в принципе любой микроскоп, имеющий дополнительный вывод изображения в плоскость, сопряженную с фотопленкой или видиконом передающей камеры.

В зависимости от задач применяется цветная или черно-белая телевизионная камера. С ее помощью изображение препарата передается на видеоконтрольный монитор. Монитор выполняет несколько задач:

— позволяет сберечь зрение, облегчая поиск нужного участка изображения,

— делает работу с микроскопом более комфортной,

— позволяет демонстрировать и обсуждать интересующие и спорные участки изображения.

На современном этапе в комплекты, в основном зарубежных, анализаторов изображения включается цифровая черно-белая камера, которая работает с накоплением, т.е. позволяет «видеть» даже объекты, имеющие малое свечение и, следовательно, невидимые глазом.

Изображение с монитора передается в компьютер, оснащенный специальной программой для анализа изображений. С помощью компьютера выполняется та часть работы, которая связана с получением и анализом необходимой информации по изображению и его элементам.

Приготовление препаратов.

Одним из основных методов клеточной биологии и гистологии является метод светлого поля в проходящем свете. Ниже описана техника приготовления препаратов для анализа при помощи этого метода.

 

Фиксация.

Цель фиксации: сохранить тканевые структуры в том состоянии, в каком они находились в момент погружения ткани в фиксирующий раствор, и одновременное их предохранение от дальнейших разрушений. Именно поэтому процесс взятия материала и переноса его в фиксирующий раствор должен быть очень быстрым. Практически все фиксаторы относятся к токсичным веществам, некоторые даже ядовиты, поэтому при работе с ними необходимо соблюдать правила техники безопасности.

Требования, предъявляемыми к фиксаторам: 1) легкое и быстрое проникновение в ткани, 2) равномерное воздействие на все компоненты клетки, 3) фиксатор не должен препятствовать последующей обработке ткани. На результаты фиксации влияют: температура, время фиксации, кислотность, химические свойства фиксатора, время, прошедшее после взятия ткани. Полноценная фиксация материала обеспечивается при соблюдении следующих требований:

1) после вырезки кусочка ткани его немедленно погружают в фиксатор;

2) объем фиксатора должен превышать объем фиксируемого материала в 10-20 раз, так как тканевая жидкость может существенно изменить концентрацию фиксатора;

3) если цвет фиксатора изменяется после погружения в него кусочков ткани, то фиксатор следует немедленно сменить;

4) недопустимо повторное использование фиксаторов;

5) для каждого фиксатора следует соблюдать установлено время фиксации.

 

фиксаторы

Простые                                                               сложные

 

Простые фиксаторы состоят из одного вещества или его раствора. Например, формалин (40% раствор формальдегида), этиловый спирт (80%, 90%, 96%, 100%), ацетон, глутаровый альдегид (используется для электронной микроскопии, как правило, 2, 5% раствор). Так например, механизм действия этилового спирта основан на осаждении белков; при этом происходит обезвоживание объекта, что значительно ускоряет процесс фиксации.

Сложные фиксаторы состоят из простых фиксатором. Например, фиксатор Буэна (состоит из пикриновой и ледяной уксусной кислот, формалина), фиксатор Карнуа (ледяная уксусная кислота, хлороформ, спирт 100% или 96%) и мн. др.

 

Обезвоживание.

После фиксации материал необходимо отмыть о

12345Следующая ⇒

Поделиться: