Методы биохимических исследований

ФЕДЕРАЛЬНОЕ АГЕНТСТВО ПО ОБРАЗОВАНИЮ

ПЕНЗЕНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ИМЕНИ В.Г. БЕЛИНСКОГО

Принято на заседании Ученого совета естественно-географического факультета протокол заседания совета факультета № ___от «___» _________2007 г. Декан факультета _____________Н.А. Кагина

УТВЕРЖДАЮ Проректор по учебной работе _________________М.А. Пятин «___» _________2007 г.

ПРОГРАММА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ

Методы биохимических исследований

СПЕЦИАЛЬНОСТЬ 020208–«Биохимия»

Факультет естественно-географический

КАФЕДРА биохимии

Пенза – 2007

1. Квалификационные требования

Квалификация выпускника – биохимик.

Нормативный срок освоения основной образовательной программы подготовки биохимика по специальности 020208 Биохимия при очной форме обучения 5 лет.

Квалификационная характеристика выпускника

Специалист-биохимик осуществляет деятельность по изучению строения и свойств химических соединений, входящих в состав живых организмов, метаболизма и его регуляции. Разрабатывает нормативные документы в своей области деятельности, организует и выполняет экспедиционные работы и лабораторные исследования; анализирует получаемую полевую и лабораторную информацию, обобщает и систематизирует результаты выполненных работ, используя современную вычислительную технику; составляет научно-технические отчеты и другую установленную документацию; следит за соблюдением установленных требований, действующих норм, правил и стандартов в области своей деятельности. Проводит экспериментальные исследования в своей области, формулирует их задачу, участвует в разработке и осуществлении новых методических подходов, обсуждении, оценке и публикации результатов, проводит патентную работу, участвует в работе семинаров и конференций, составлении патентных заявок.

В производственных и медицинских организациях проводит биохимическую аналитическую работу, участвует в диагностике и экспертизе, сертификации продуктов производства.

Исходя из своих квалификационных возможностей, специалист-биохимик подготовлен к самостоятельной работе на должностях биохимика, врача-лаборанта, биолога, лаборанта-исследователя, инженера-исследователя, научного сотрудника в научно-исследовательских и научно-производственных учреждениях, и других должностях, в соответствии с требованиями Квалификационного справочника должностей руководителей, специалистов и других служащих, утвержденных постановлением Минтруда РФ от 21.08.98 № 37.

Специалист-биохимик подготовлен к педагогической деятельности на должности преподавателя в средней школе и учреждениях профессионального образования при условии освоения дополнительной образовательной программы психолого-педагогического профиля.

Область профессиональной деятельности

Исследование строения и физико-химических свойств химических соединений, входящих в состав живых организмов, метаболизма и молекулярных механизмов его регуляции.

Объекты профессиональной деятельности

Вирусы и микроорганизмы, клеточные органеллы и одиночные клетки, многоклеточные организмы (растения и животные).

Виды профессиональной деятельности

· Проведение научных исследований в области биохимии и молекулярной биологии: сбор и подготовка научных материалов, квалифицированная постановка экспериментов, обработка результатов клинических анализов и экспериментальных исследований.

· Научно-производственная и организационная деятельность;

· Педагогическая деятельность (при условии освоения соответствующей образовательно-профессиональной программы педагогического профиля) преподавание в средней и высшей школе, осуществление просветительской деятельности.

· Иные виды деятельности, позволяющие использовать базовую биологическую подготовку и подготовку по специальности 020208 – Биохимия.

2. Требования ГОС по дисциплине

Методы препаративной химии и биохимии; методы выделения органелл; разные виды хроматографии, в том числе аффинная хроматография; разные виды электрофореза, в том числе иммунный электрофорез; методы дифференциального центрифугирования, спектральные методы; методы меченых атомов; методы химической модификации белков и мембран; программирование и др.

3. Цели и задачи дисциплины

Курс «методы биохимических исследований» должен ознакомить студентов с основными методами исследований, используемых в биохимии.

Целью курса является подготовка высококвалифицированных биохимиков, способных выполнять исследования, самостоятельно планировать ход работы и подбирать необходимые методы для решения конкретных задач.

«Методы биохимических исследований» – это лекционный курс.

В курсе «методы биохимических исследований» изучаются теоретические основы биохимических методов исследований, основные методологические и методические приемы, необходимые для успешного применения этих методов. Особое внимание в курсе отводится современным хроматографическим и электрофоретическим методам исследований, видам современного лабораторного оборудования и приемам работы с ним.

Успешное освоение курса «методы биохимических исследований» подготовит студентов к проведению научных исследований в области биохимии и молекулярной биологии.

4. Место дисциплины в профессиональной подготовке студентов

Дисциплина методы биохимических исследований относится к специальным дисциплинам и дисциплинам специализации федерального компонента.

Распределение времени, отведенного на изучение дисциплины по учебному плану

Форма учебной работы

Форма обучения

Очная

По семестрам

Общая трудоёмкость, всего часов

Аудиторные занятия (АЗ)

Лекции (Л)

Практические занятия (ПЗ)

Семинары (С)

Лабораторные занятия (ЛЗ)

Другие виды аудиторных занятий

Самостоятельная работа (СР)

Контрольная работа

Компьютерное тестирование

Курсовая работа

Форма итогового контроля (зачет, экзамен)

экзамен

Тематические планы для очной формы обучения на 7 семестр

№ п/п	Темы	Кол-во часов
№ п/п	Темы	Лекций	Самост.
1.	Оборудование биохимической лаборатории. Общие принципы биохимического исследования.	2	2
2.	Разрушение клеток и экстракция. Центрифугирование.	2	2
3.	Разделение белков путем осаждения. Осаждение нуклеиновых кислот.	3	3
4.	Буферные растворы и специальные добавки. Ультрафильтрация. Диализ. Детергенты и их применение.	2	2
5.	Общие принципы хроматографии, классификация хроматографических методов.	2	2
6.	Материалы матриц сорбентов и обменников. Техника колоночной хроматографии.	2	2
7.	Адсорбционная и распределительная хроматографии.	2	2
8.	Тонкослойная хроматография.	1	2
9.	Ионообменная хроматография.	1	2
	Итого:	17	19

На 8 семестр

№ п/п		Темы	Кол-во часов
№ п/п		Темы	Лекций	Самост.
1.		Ионообменная ЖХВД белков. Хроматофокусирование.	1	1
2.		Аффинная хроматография.	2	2
3.		Гель-фильтрация.	3	3
4.		Теоретические и методические основы электрофореза.	3	3
5.		Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез.	2	2
6.		Обнаружение, количественное определение и характеристика макромолекул после электрофореза.	2	2
7.		Принцип иммунного электрофореза. Иммунофиксация.	1	1
8.		Электросинерез. Электроиммуноанализ. Перекрестный иммуноэлектрофорез.	1	1
9.		Методы меченых атомов.	2	2
10.		Спектрофотометрические методы анализа.	2	2
11.		Флюориметрические методы анализа.	1	1
12.		Иммуноферментный анализ	1	1
13.		Радиометрический анализ. Масс-спектроскопия.	1	1
	Итого:		22	22

Содержание дисциплины

Введение

История развития методов биохимических исследований. Роль методического обеспечения в развитии биохимии. Классификация методов исследования в биохимии. Применение биохимических методов в медицине, биотехнологии, экологии и др. отраслях

Методы выделения органелл

Приготовление экстракта. Исходный материал. Особенности различных видов живых организмов в качестве исходного материала биохимических исследований. Свежесть сырья и его хранение.

Разрушение клеток и экстракция. Способы разрушения клеток. Растворы, используемые для экстракции. Буферные растворы и специальные добавки. Оптимизация и осветление экстракта. Особенности приготовления экстрактов растительных тканей и микроорганизмов.

Методы, используемые при очистке белков, ассоциированных с частицами. Детергенты и их применение.

Хроматография

5.1. Классификация и элементы теории хроматографии

Классификация хроматографических методов. Классификация по принципу фракционирования. Классификация по способу элюции. Классификация по расположению неподвижной фазы.

Элементы теории хроматографической элюции. Хроматографический процесс. Хроматографическая зона. Концепция теоретических тарелок. Кинетическая теория хроматографии. Разрешение близко мигрирующих зон. Оптимизация условий фракционирования. Градиентная элюция. Хроматография макромолекул.

5.2. Материалы матриц сорбентов и обменников

Целлюлоза. Гели на основе декстрана (сефадексы). Агароза. Полиакриламидный гель. Сефакрилы. Ультрогели. Полистирольные смолы. Полиамидные смолы. Кизельгур (целит, диатомовая земля). Силикагель. Окись алюминия. Пористое стекло. Оксиапатит.

5.3. Техника колоночной хроматографии

Хроматография при низком давлении. Хроматографические колонки. Резервуары для элюента. Смесители. Внесение препарата в колонку. Перистальтические насосы. Детекторы. Коллекторы фракций. Вспомогательное оборудование.

Хроматография при высоком давлении. Колонки. Внесение препарата. Задание градиента элюции. Детекторы.

Хроматография при умеренном давлении.

5.4. Гель-фильтрация

Общая характеристика метода. Принцип метода. Коэффициенты распределения. График селективности. Эффективность фракционирования.

Характеристика продажных матриц.

Методические особенности гель-фильтрации при низком давлении. Подготовка матрицы. Набивка колонки. Проверка качества набивки. Определение V₀. Внесение препарата. Поддержание рабочего режима. Регенерация колонки.

Выбор параметров хроматографического процесса. Выбор матрицы. Размеры колонки. Выбор элюента. Скорость элюции. Оптимизация условий эксперимента.

Области применения. Очистка и фракционирование макромолекул. Определение молекулярной массы белка. Обессоливание и смена буфера.

Гель-фильтрация при высоком давлении. Гель-фильтрация в тонком слое.

5.5. Распределительная хроматография

Принцип метода. Нормальнофазовая распределительная хроматография. Распределительная хроматография в обращенных фазах.

Обратнофазовая гидрофобная хроматография при низком давлении. Немодифицированная сефароза. Элюция снижающимся градиентом концентрации соли. Гидрофобизированные гели агарозы.

Распределительная хроматография при высоком давлении.

5.6. Адсорбционная хроматография

Принцип метода. Сорбенты. Приготовление оксиапатита. Сорбционные свойства оксиапатита. Сорбция белков. Сорбция нуклеиновых кислот. Некоторые особенности хроматографии на оксиапатите. Фракционирование и очистка белков. Фракционирование и очистка нуклеиновых кислот. Разделение двунитевой и однонитевой ДНК. Очистка гибридов ДНК-РНК.

5.7 Ионообменная хроматография

Принцип метода. Компоненты хроматографической системы. Ионообменники. Элюент. Хроматографируемые вещества. Хроматографический процесс. Ионные взаимодействия вещества и сорбента. Управление силой ионного взаимодействия. Неионные взаимодействия вещества и сорбента.

Характеристики продажных ионообменников.

Подготовка обменников к набивке в колонку. Преформирование и промывка. Перевод в нужную ионную форму. Опасность поглощения СО₂.

Применение статической ионообменной хроматографии. Нейтрализация щелочи или кислоты без образования соли. Замена ионов. Обессоливание растворов. Удаление некоторых органических примесей. Концентрирование препаратов. Разделение компонентов смеси, сильно различающихся сродству к обменнику.

Выборусловий динамической ионообменной хроматографии. Выбор ионообменника. Выбор типа элюции. Выбор рН буфера для элюции. Выбор концентрации соли. Сохранение нативности препарата. Выбор объема элюента. Выбор размеров колонки. Выбор скорости элюции. Сбор и обработка фракций. Регенерация ионообменника.

Применение динамической ионообменной хроматографии.

Ионообменная ЖХВД белков.

Хроматофокусирование. Принцип метода. Колонки для хроматофокусирования. Фракционирование белков.

5.8. Аффинная хроматография

Принцип метода. Компоненты аффинного сорбента. Матрицы. Активация матриц. Спейсеры. Активированные спенсеры. Лиганды с индивидуальной специфичностью. Лиганды с групповой специфичностью. Посадка лигандов на активированные матрицы. Посадка лигандов на спейсеры с помощью конденсирующих агентов. Характер закрепления лиганда на матрице. Иммобилизация нуклеиновых кислот в качестве лигандов. Сорбенты для ковалентной хроматографии.

Выбор условий хроматографии. Выбор сорбента и характера хроматографического процесса. Выбор концентрации лиганда. Загрузка сорбента. Выбор буфера для посадки вещества. Выбор элюента и метода элюции. Биоспецифическая элюция. Проведение эксперимента. Электрофоретическая элюция. Аффинная элюция с ионообменника.

Применение аффинной хроматографии.

Аффинная ЖХВД. Аффинный электрофорез

5.9. Тонкослойная хроматография

Особенности метода. Техника ТСХ. Приготовление пластинок. Нанесение препаратов. «Проявление» пластинок (хроматографическая элюция). Обнаружение пятен или полос. Элюция вещества с пластинки.

Применение ТСХ.

Электрофорез

6.1. Теоретические и методические основы электрофореза

Принципы электрофореза. Электрофорез с подвижной границей. Зональный электрофорез без поддерживающей среды. Непрерывный электрофорез в тонком слое жидкости (проточный электрофорез в свободной среде). Зональный электрофорез в градиенте плотности.

Зональный электрофорез в поддерживающей среде с капиллярной структурой. Электрофорез на фильтровальной бумаге. Электрофорез на ацетате целлюлозы.

Электрофорез в колонках и блоках гранулированной поддерживающей среды.

Электрофорез в агаровом и агарозном гелях. Теория электрофореза в агаровом (агарозном) геле. Аналитический электрофорез в агаровом (агарозном) геле. Препаративный электрофорез в агаровом и агарозном гелях.

Электрофорез в крахмальных гелях.

Электрофорез в полиакриламидном геле. Теория электрофореза в полиакриламидном геле. Физико-химические свойства составных частей геля. Аналитический электрофорез в полиакриламидных гелях. Препаративный электрофорез в полиакриламидном геле

6.2. Изоэлектрическое фокусирование и изотахофорез

Изоэлектрическое фокусирование. Принцип метода. Формирование градиентов рН. Методические приемы изоэлектрического фокусирования. Трудности, связанные с разделением белков методом ИЭФ. Аналитическое и препаративное изоэлектрическое фокусирование

Изотахофорез

6.3. Обнаружение, количественное определение и характеристика
макромолекул после электрофореза

Выявление макромолекул по поглощению ультрафиолетового света и флуоресценции. Выявление разделенных при электрофорезе компонентов путем их окрашивания. Сканирование окрашенных электрофореграмм. Фотографирование электрофореграмм. Высушивание полиакриламидных гелей. Разрезание полиакриламидных гелей. Выявление радиоактивности после электрофореза.

6.4. Электрофорез белков

Поведение белков при электрофорезе. Разделение белков в соответствии с размерами молекул: определение их молекулярной массы. Двухмерный электрофорез.

Окрашивание белков на электрофореграммах. Обнаружение белков по их ферментативной активности.

6.5. Электрофорез нуклеиновых кислот и нуклеопротеидов

Электрофоретические методы разделения нуклеиновых кислот и полинуклеотидов. Электрофорез нуклеиновых кислот в агаровом и агарозном гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидных гелях. Электрофорез нуклеиновых кислот в полиакриламидно-агарозных гелях. Особые проблемы, возникающие при электрофоретическом разделении нуклеиновых кислот. Изоэлектрофокусирование нуклеиновых кислот. Обнаружение нуклеиновых кислот после электрофореза. Препаративный электрофорез нуклеиновых кислот в геле. Микрометоды электрофоретического разделения нуклеиновых кислот. Определение молекулярной массы полинуклеотидов. Электрофорез нуклеопротеидных частиц.

Иммунный электрофорез

Принцип метода. Реакции антиген-антитело. Иммуноэлектрофорез в агаровых или агарозных гелях. Диффузия и преципитация в геле.

Иммунофиксация. Принцип метода. Оценка метода. Область применения.

Электросинерез (встречный электрофорез, электроиммуноосмофорез). Принцип метода. Оценка метода. Область применения.

Электроиммуноанализ (электроиммунодиффузия, ракетный иммуноэлектрофорез). Принцип метода. Количественное определение антигенов. Модификации метода. Область применения. Оценка метода.

Перекрестный иммуноэлектрофорез (перекрестный электрофорез в системе - антиген-антитело). Принцип метода. Оценка метода. Область применения.

Способы усиления преципитации при электроиммуноанализе и перекрестном иммуноэлектрофорезе

Спектральные методы

Спектр электромагнитного излучения, его основные характеристики и способы их выражения (длина волны, частота, волновое число, поток излучения, интенсивность). Ультрафиолетовая, видимая и инфракрасная области спектра. Классификация спектроскопических методов.

Спектрофотометрический метод анализа. Сущность метода. Законы поглощения электромагнитного излучения и способы их выражения. Закон Бугера-Ламберта-Бера, его математическое выражение. Величины, характеризующие поглощение. Молярный коэффициент поглощения. Оптическая плотность. Оптимальный интервал измеряемых значений оптической плотности (кривая ошибок). Критерии соблюдения законов поглощения и оценка чувствительности фотометрической реакции. Построение калибровочного графика. Способы определения концентраций веществ. Дифференциальный метод. Спектрофотометрическое титрование. Использование спектрофотометрии в хроматографии. Фотоэлектроколориметры и спектрофотометры. Применение колориметрии и спектрофотометрии.

Флюориметрические методы анализа. Различные виды люминесценции и их классификация. Основные закономерности молекулярной фотолюминесценции. Независимость спектров люминесценции от длины волны возбуждающего света. Тушение люминесценции: температурное, концентрационное, тушение посторонними примесями. Практическое применение метода. Хемилюминисцентный анализ.

Методы меченых атомов

Радиоактивные изотопы, используемые в биологии. Измерение радиоактивности. Авторадиография: принцип метода, техника проведения авторадиографии, преимущества и недостатки. Сцинтилляционные счетчики излучения: принцип действия, сцинтилляторы. Счет радиоактивности на фильтрах. Введение радиоактивной метки в биологические препараты in vivo и in vitro. Радиоиммуноанализ.

Иммуноферментный анализ

Принцип иммунного анализа. Получение антител с требуемой специфичностью. Пришивание фермента к антителам. Варианты методик ИФА. Современная аппаратура.

Биохимические анализаторы

Использование проточных замкнутых систем в анализе.

14. Оптимизация методов выделения и очистки биологических макромолекул и соблюдение рекомендаций

Быстрота и разрешение: временной фактор. Возможные последовательности процессов фракционирования. Стабилизация макромолекул в процессе выделения и очистки. Хранение препаратов макромолекул. Замораживание и оттаивание.

Увеличение и уменьшение масштабов операций. Воспроизведение опубликованной методики. Программирование.

Список основной литературы

1. Аффинная хроматография: Методы. Под ред. П.Дин, У.Джонсона, Ф.Мидл. М.: Мир, 1988.

2. Гекселер К., Экштайн Э. Аналитические и препаративные лабораторные методы. М.: Химия, 1994.

3. Гааль, Э., Медьеши Г., Верецкеи Л. Электрофорез в разделении биологических макромолекул. М.: Мир, 1982.

4. Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир, 1989.

5. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука, 1985.

6. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука, 1983.

7. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и центрифугирование. М.: Наука, 1981.

8. Остерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. М.: МЦНМО, 2002.

9. Практикум по биохимии. Под редакцией С.Е.Северина и Г.А.Соловьёвой. М.: Издательство МГУ, 1989.

Требования к уровню освоения программы

В результате изучения данной дисциплины студент должен:

знать основные методы и методические приемы, использующиеся в современных исследованиях а области биохимии и молекулярной биологии.

уметь применять приемы работы с биологическим материалом.

владеть приемами и навыками работы с современным биохимическим оборудованием.

Темы курсовых работ

1. Очистка ФМСФ-КП методом гель-фильтрации.

2. Очистка ФМСФ-КП методом ионно-обменной хроматографии.

3. Очистка ФМСФ-КП методом афинной хроматографии.

4. Современные биохимические анализаторы: обзор.

5. Ферментный электрод.

6. Время-пролетная масс-спектрометрия.

7. Жидкостная хроматография высокого давления.

8. Полимеразная цепная реакция.

9. Твердофазные ферментные реакции.

10. Множественные квадрупли в масс-спектрометрии: преимущества и недостатки.

11. Методы определения кинетико-термодинамических свойств ферментов.

12. Методы изучения мембранных компонентов.

13. Дифференциальное центрифугирование: способы и современное приборное обеспечение.

14. Использование радиоактивных меток в анализе.