Обработка с использованием N-ацетил-l-цистеина и гидроокиси натрия (NALC-NаOH).

Применение муколитического препарата N-ацетил-L-цистеина (NALC), используемого для быстрого разжижения мокроты, позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего вещества (NaOH) до конечной концентрации 1% при смешивании с пробой. Этот метод повышает высеваемость микобактерий, однако требует больше затрат времени и средств. Ацетилцистеин в растворе быстро теряет активность, поэтому раствор нужно готовить ежедневно. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие N-ацетил-L-цистеина.

Обработку материала NALC-NаOH производят следующим образом:

К 10 мл или меньше диагностического материала добавляют равный объем раствора NALC-NаOH, встряхивают в течение 10-20 секунд для перемешивания пробы, затем оставляют на 15 минут при комнатной температуре. Если необходима более эффективная деконтаминация, можно повысить концентрацию NaOH до 5-6%, не увеличивая время экспозиции пробы с деконтаминирующим раствором.

После 15-минутной экспозиции доводят объем пробы до 50 мл дистиллированной водой, перемешивают и центрифугируют при 3000g в течение 15 мин. Надосадочную жидкость отбирают. Осадок немедленно засевают на питательную среду с параллельным приготовлением мазка.

Приготовлениее яичных сред и посев на них

Среда Левенштейна-Йенсена

Среда Левенштейна-Йенсена применяется во всем мире в качестве стандартной среды для первичного выделения возбудителя туберкулеза и определения его лекарственной чувствительности. Эта среда рекомендуется для использования всеми микробиологическими лабораториями противотуберкулезной службы Республики Беларусь для получения сравнимых результатов. Это плотная яичная среда, на которой хороший рост микобактерий туберкулеза получают на 15-25-й день после посева микроскопически положительного материала. В состав этой питательной среды входит глицерин, который способствует росту M. tuberculosis.

Состав среды:

Раствор минеральных солей:

Калий однозамещенный фосфорнокислый - 2, 4 г,

Магний лимоннокислый - 0, 24 г

Магний сернокислый - 0, 6 г

L-аспарагин - 3, 6 г

Глицерин - 12, 0 мл

Вода дистиллированная - 600 мл

Ингредиенты растворяют в дистиллированной воде в указанной последовательности при слабом подогревании (не доводя до кипения) на водяной бане. Затем стерилизуют в автоклаве при 0, 5 атм. (112°С) в течение 30 минут. Срок хранения раствора составляет 3-4 недели при комнатной температуре.

Раствор малахитового зеленого:

Малахитовый зеленый - 2 г

Вода дистиллированная - 100 мл

Малахитовый зеленый растворяют в стерильной дистиллированной воде, поместив раствор в термостат на 1-2 часа. Стерилизуют при 0, 5 атм. (112°С) в течение 20 минут. Приготовленный раствор не подлежит длительному хранению, и при появлении осадка или изменении окраски его следует заменить свежим раствором.

Яичная масса:

Свежие диетические куриные яйца со сроком хранения не более 7 суток без трещин и дефектов скорлупы тщательно отмывают в теплой проточной воде с помощью ручных щеток и щелочного мыла, оставляют на 30 мин в мыльном растворе. Тщательно промывают в проточной воде и погружают в 70° этиловый спирт на 30 мин. Затем в стерильном боксе разбивают яйца стерильным ножом в стерильную посуду, доводя общий объем яичной массы до 1 л (для этого требуется в среднем 20-25 яиц в зависимости от их величины). Тщательно гомогенизируют в стерильном миксере.

Приготовление среды.

В большую стерильную емкость вносят 600 мл раствора минеральных солей, 1000 мл гомогенизированной яичной массы, тщательно перемешивают и фильтруют через четырехслойный стерильный марлевый фильтр. Добавляют 36 мл раствора малахитового зеленого, тщательно перемешивают, избегая образования пены, разливают в пробирки приблизительно по 5 мл, следя за тем, чтобы в растворе не образовался осадок. Для предупреждения выпадения осадка пробирки с яичной средой помещают в свертыватель не позже чем через 15 минут после разлива среды.

Свертывание среды.

Пробирки с разлитой в них средой помещают в штативы со специально подобранным углом наклона для формирования скошенной среды. Штативы устанавливают в свертыватель и проводят коагуляцию при 80°С в течение 45 минут.

Контроль стерильности:

После свертывания каждую вновь приготовленную партию среды подвергают контролю на стерильность. Для этого несколько пробирок со средой из партии помещают в термостат и выдерживают в нем 2-3 суток при 37°С.

Хранение:

На пробирках с приготовленной партией среды указывают дату изготовления. Среду хранят в холодильнике при 4°С с тщательно закрытыми пробками для предотвращения высыхания. Срок хранения среды не должен превышать 4 недели

Процедура посева

Перед процедурой посева необходимо подготовить пробирки с питательными средами, промаркировать их согласно нумерации анализов в рабочем журнале и последовательно расположить в вертикальном штативе. Аналогичным образом подготовить и промаркировать предметные стекла для приготовления мазков.

В нижней части пробирки со скошенной питательной средой нередко наблюдается образование конденсата. До посева биологического материала этот конденсат желательно удалить. Не следует производить посев на среды, только что вынутые из холодильника. Нужно вынимать их из холодильника заранее, чтобы среда к моменту посева согрелась до комнатной температуры.

Посев диагностического материала производят следующим образом:

–  стерильной пипеткой набирают 1, 0-1, 2 мл полученного после обработки и нейтрализации осадка, оставив приблизительно 0, 2 мл для последующего приготовления мазка для микроскопии;

–  соблюдая стерильность, вносят равные объемы пробы диагностического материала (примерно по 0, 5-0, 6 мл) на верхнюю треть скошенной питательной среды в 2 пробирки с разными плотными питательными средами;

–  засеянные пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и помещают их в наклонном положении в штатив таким образом, чтобы материал равномерно распределился по всей поверхности питательной среды;

–  по завершении посева всех проб засеянные пробирки помещают в термостат при температуре 37°С; наклон штатива должен обеспечивать горизонтальное расположение поверхности питательной среды и исключать смачивание пробки засеянным материалом.

После посева пробирки желательно инкубировать так, чтобы поверхность скошенной среды оставалась горизонтальной - по крайней мере, в течение первых 2-3 суток после посева. Затем ватно-марлевые пробки заменяют герметичными резиновыми или силиконовыми, после чего засеянные пробирки переводят в вертикальное положение.

Микобактерии туберкулеза размножаются чрезвычайно медленно. С этим связана необходимость длительного срока инкубации для получения видимого роста колоний. При первичном посеве микроскопически отрицательного материала средняя продолжительность появления видимого роста микобактерий туберкулеза на плотных питательных средах может составить 20-46 дней. Рост отдельных штаммов появляется через 60 и даже 90 дней. Это обусловливает необходимость выдерживать посевы в термостате до 10 недель для выдачи отрицательного результата при отсутствии роста микобактерий.

Подготовка пробирок и посев образца для автоматизированной системы BACTEC MGIT 960

Пробирка MGIT 960 содержит модифицированную бульонную основу 7H9. Примерная формула содержит следующие компоненты на 1000 мл дистиллированной воды:

модифицированная бульонная основа Мидлбрук 7H9 - 5, 9 г

казеиновый пептон - 1, 25 г.

Формула корректируется с возможным внесением добавок в зависимости от функциональных требований. На дне пробирки имеется помещенный в силикон флуоресцентный датчик. Пробирку во время наполнения промывают 10% CO₂, затем закрывают полипропиленовой завинчивающейся крышкой. Крышку открывать следует только в случае необходимости внесения каких-либо веществ в среду.

Для системы BACTEC MGIT 960 предусмотрена ростовая добавка MGIT (MGIT Growth Supplement. Добавку необходимо добавлять в пробирку MGIT до инокуляции пробы. В состав ростовой добавки MGIT на 1 000 мл дистиллированной воды входят:

бычий альбумин 50, 0 г

декстроза 20, 0 г

каталаза 0, 03 г

олеиновая кислота 0, 1 г

полиоксиэтилена стеарат 1, 1 г

Для снижения риска контаминации используется смесь антибиотиков PANTA, которая вносится в пробирку MGIT до инокуляции проб вместе с обогатительной добавкой. Каждый флакон MGIT PANTA (для MGIT 960) содержит лиофилизированную смесь антибактериальных препаратов со следующей концентрацией на момент изготовления:

полимиксин B 6, 000 ед.

амфотерицин B 600 мг

налидиксовая кислота 2, 400 мг

триметоприм 600 мг

азлоциллин 600 мг

Процедура подготовки пробирок MGIT и посев образца.. Разведение лиофилизированной добавки PANTA

Растворить PANTA (добавку с антибиотиками для подавления роста посторонней флоры) в 15 мл обогатительной добавки MGIT Growth Supplement, добавив ее во флакон с PANTA. Оставить на 15 минут.

Добавить 0, 8 мл полученного раствора в каждую пробирку MGIT непосредственно перед посевом материала.

Все манипуляции проводить в ламинарном боксе II - класса защиты.

b. Посев в пробирку MGIT

Все этапы работы должны выполняться только в ламинарном боксе II - класса защиты.

Внимательно осмотреть пробирку MGIT и убедиться, что она пригодна для работы (наличие силиконового кольца на дне пробирки, объем жидкости - 7 мл, крышка плотно закрыта).

Написать на пробирках идентификационные лабораторные номера.

С помощью стерильной одноразовой пипетки внести 0, 5 мл ресуспендированного осадка в подготовленною пробирку MGIT и 0, 1-0, 25 мл в пробирку с плотной питательной средой Левенштейна-Йенсена.

Закрыть немедленно после внесения плотно крышку пробирки и аккуратно несколько раз перевернуть пробирку, чтобы перемешать содержимое.

Обработать снаружи пробирки и пробки дезсредством, поместить пробирки в штатив и оставить на 30 минут при комнатной температуре.

Для исключения перекрестной контаминации и поддержания оптимальной концентрации углекислого газа в пробирках, всегда необходимо открывать только одну пробирку на минимально возможное время.

с. Меры предосторожности

Основным источником контаминации среды MGIT являются микроорганизмы из окружающей среды, попавшие в пробирку во время внесения добавок и материала, поэтому необходимо соблюдать следующие правила:

. Все добавки вносить только в ламинарном боксе II-класса защиты.

. Не открывать несколько пробирок одновременно.

. Открывать пробирку MGIT на максимально короткое время.

. При внесении ростовой добавки рекомендуется пользоваться дозатором.

. Всегда плотно закручивать крышку. Если она сидит неплотно, могут возникнуть сложности с детекцией флуоресценции.

. Проба, внесенная в пробирку объемом более 0, 5 мл, может повлиять на показатель pH среды и вызвать ложную флуоресценцию, а также может усилить контаминацию.

d. Инкубация

Все засеянные пробирки MGIT необходимо поместить в прибор. Протокол исследования на автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 - 6 недель.

Температура инкубации для микобактерий туберкулеза + 37°С, допустимые колебания температуры от + 35°С до +38°С. В процессе инкубации встряхивание и перемещение пробирок запрещено.

е. Детекция положительного роста

О появлении положительной пробирки прибор сообщает появлением красной индикации на наружной панели соответствующего ящика и значка " +", а также звуковым сигналом.

При наличии индикации о положительном результате необходимо открыть указанный ящик; нажать клавишу под иконкой " извлечь положительные пробирки"; извлечь пробирку из указанной прибором ячейки; считать штрих-код извлеченной пробирки.

Следует просмотреть пробирку и визуально определить наличие роста микобактерий. Обычно в жидкой среде микобактерии растут в виде своеобразной " зернистости" или белых хлопьев, при этом прозрачность среды может почти не меняться. Как правило, рост микобактерий сосредоточен на дне пробирки. Сильное помутнение среды может свидетельствовать о наличии контаминации посторонней флорой.

Максимальное время инкубации пробирок в приборе MGIT - 42 дня. Пробирки, в которых размножение микобактерий не зафиксировано прибором в течение указанного времени, идентифицируются системой как отрицательные. В этом случае прибор сообщает появлением зеленой индикации на наружной панели соответствующего ящика и звуковым сигналом.

Для того чтобы извлечь " отрицательные" пробирки, необходимо открыть соответствующий ящик и нажать клавишу под иконкой " извлечь положительные пробирки" - прибор укажет зеленым световым сигналом на те пробирки, которые необходимо удалить. Необходимо извлечь пробирку из ячейки и отсканировать штрих-код, а также просмотреть пробирку, пытаясь визуально определить наличие возможного роста микобактерий и контаминации (мутность, дисперсность и т.д.).

При наличии сомнений в правильности отрицательного результата (наличие мутности, зернистости и т.д.), следует приготовить мазки для микроскопического исследования и произвести посев материала на кровяной агар для контроля контаминации и на среду Левенштейна.

⇐ Предыдущая1234Следующая ⇒

Поделиться: