Микроклональное размножение.

Применяется:

1.когда невозможно размножить вегетативно (дуб);

2.слишком мало материала или опасно трогать объект;

3.когда необходимо исследовать воздействие химиката на определенный фактор и учесть действие на каждую клетку;

4.когда нужно получить в промышленных количествах клоны вида или ГМО;

5.когда нужно поддерживать в состоянии каллуса какой-нибудь редкий вид.

Для МКР необходимо использовать специальную лабораторию, где поддерживают стерильность инструментария, субстратов и самих каллусов. Нарушение приводят к зарастанию питательных средств грибами и бактериями.

Лаборатория включает в себя:

1. отделение с автоклавами, т.е. аппаратами, где при высоком давлении подвергается стерилизации инструменты, одежда, реактивы;

2. хранилище сред и их компонентов, лаборатория для приготовления сред,

3. санпропускник в операционную,

4. операционная,

5. термостатируемая комната, где находятся шкафы для темного выращивания, стеллажи для светлого и качалки для суспензионных культур.

Рис.1. Устройство лаборатории.

А-автоклавы (давление до 2 атм, 20 м воды)tдо 150⁰С, специальный допуск человека(как права).

Должен быть: физические весы до 0, 001гр, лабораторная посуда(мензурки, пипетки, стаканы, конические колбы, хранилища-люки, магнитная мешалка, хранилища всех реактивов, холодильник).

Операционно-ламинарные боксы.

Если нет шкафа, то стерильный стол.

Ламинарный бокс для стерильных манипуляций.

В нерабочее время помещение кварцуют, в т.ч. внутри ламинарного бокса.

Рабочую поверхность бокса и стола протирают спиртом или формалином. Стерильный стол используют при отсутствии ламинарного бокса, и при его использовании на каждый край ставят горелку Бунзена или спиртовку.

Термостатируемая комната.

Где есть устройство кондиционирования, t=25 2⁰C. Режим освещения в зависимости от требований к растущим культурам. Напр. для некоторых культур нужен свет. Для этого используют стеллажи с трубчатыми лампами, под каждым стеллажом на потолке. Могут быть шкафы для культур с теневым выращиванием, в этом случае применяемые обычные закрытые шкафы или все комнаты могут сделать темной.

Суспензионные культуры не должны слипаться, поэтому их должны выращиваться при постоянном перемешивании в качалках, которое делают (оборот в секунду и отклоняют ось вращения на несколько см по вертикали). В качалках или в самой комнате может быть установлен режим смены дня и ночи.

Компоненты сред.

Каждая среда независимо от назначения имеет 6 компонентов:

1.микроэлементы

2.макроэлементы

3.источник железа

4.источник углерода

5.витамины

6.стимуляторы роста, которые подбираются к каждому виду.

Ауксины:

ИУК(индолилуксусная кислота)

ИМК(индолилмасляная кислота)

НУК(нафтилуксусная кислота)

НОУК(хлорфинилоксиуксусная кислота)

Цитокинины:

6-БАП-(6-бензиламинопурин)

2-ИП(изопентиламинопурин)

Кинетин (фурфуриламинопурин)

Зеатин.

Гиббереллины:

ГК (гибберелловая кислота)

ИУК окисляется продуктами метаболизма тканей, его нельзя использовать как единственный ауксин.

Зеатин и ГК- термолобильны и их нельзя автоклавировать.

Одним из компонентов среды, дающие ей желирующие свойства являются, напр. (из водорослей) его кладу 6 гр на 1 л среды.

Подбор регуляторов роста:

0 1 2 3 4 5 А 0

А-3-4

Ц-3-4

МС-(мурасиге-скуга)

Приготовление сред.

Среды: высокосолевые (Мурасиге-Скуга, Шенка-Хиледебрандта); низкосолевые - (Уайта)

Среды либо готовят сами (в лаборатории), либо используют готовые порошки, в которых входят все компоненты, кроме сахарозы, агара и регуляторов роста. Но такие среды, несмотря на удобство, не могут быть изменены и дорого стоят. В лаборатории же имея стандартный набор посуды и необходимые реактивы можно приготовить любую среду.

Методика приготовления:

Берут пропись и готовят растворы исходных солей. Растворять их можно в химическом стакане на магнитной мешалке. В последствии растворы объединяют, и объем доводится до риски дважды дистиллированной средой. Все компоненты растворяются стерильной дважды дистиллированной водой. Все соли используют марки ХЧ - химически - чистые, ЧДА - чистые для анализа. Приготовленную среду разливают в конические колбы Эрленмейера по 250 мл, затыкают ватными пробками и оборачивают горлышко фольгой.

Автоклавируют при 115⁰С (до 150⁰С) и при давлении 1, 1 атм (до 24) 20 мин(чем больше V, тем больше t).

Готовую среду остужают напр., в ламинарном боксе, где можно подлить термолабильные компоненты, а так же их там разливают по чашкам петри.

Готовую среду лучше не хранить во избежание заражения. Если же все-таки храним, то это делают 1 месяц с обязательным последовательным посевом, а лучше с пробой самих колб на стерильность. Для этого среду помещают в термостат при t-25⁰С на 4 дня. Если через 4 дня не проявляются признаки заражения грибами или микроорганизмами среду можно использовать. Среды, хранятся при t +4⁰С. Растворы основных солей +4⁰С, а витамины при -20⁰С хранятся 1 месяц (по 2 мл в колбочке).

Метод посева применяетсядля определения факта заражения сред, физиологических жидкостей, водных смывов с любых поверхностей(они со стен в операционных, автоклавной, и т.д.)).Для смыва со стен берут стерильную кисточку.

Эксплант- часть растения, которая должна быть по возможности наиболее молодой, чтобы не возникло трудностей, либо конкретная ткань, которую нужно размножить. Желательно чтобы эксплант был теристемой- вечно молодой тканью(кончик побега, корня, кисток). Размер экспланта зависит от размера его клеток, чем больше размер клеток, тем больше размер экспланта, т.к. существует критическое количество жизнеспособных клеток для каллусных культур. Перед тем как эксплант помещают на среду, его нужно отобрать и простерилизировать.

Стерилизация экспланта:

Эксплант должен быть стерилен, чтобы не заражать среду и одновременно жив, чтобы расти. Поэтому используют хлорсодержащие жидкости 1% активного хлора.

ПР: Раствор гипохлоританатрия. Для лучшего прилипания гидрохлорита натрия и водоотталкивающим гидрофобным поверхностям используют смачиватели - детергенты (типол). При стерилизации некоторых тканей их даже оставляют набухать, напр., кожура семян, чтобы открылись микротрещинки.

Как правило, стерилизованный экплант идет в несколько этапов, т.е. замачивают в гидрохлорите натрия и промывают дважды дистиллированной водой, затем это может повторяться.

Выращивание эксплантов

В готовую среду, разлитую по чашечкам петри вдавливают эксплант. Если лист кладут горизонтально, стебель вертикально. Если среда подобрана правильно, то через месяц можно будет разделить растущий каллус (растущая ткань в результате деления клеток, т.е. пролифирации). Каллус можно разделить на несколько частей с соблюдением правильного размера экспланта. Если можно разделить на 10 частей, то через 6 месяцев 1000000 каллусов.

В условиях клонирования настоящей коэффициент разложен ниже из за неизбежной мутации и деградации клонов, которые составляют некоторый %.

Этапы микроклонального размножения:

1.Выбор растения – донора, изоляция эксплантов и получение хорошо растущей стерильной культуры.

2.Собственно микроразмножение, когда получают максимальное количество жизнеспособных эксплантов.

3.Укоренение размножающихся побегов с последующей адаптацией к почве, а при необходимости - депонирование растений-регенерантов при t +2+10⁰С.

4.Выращивание растений в полевых условиях (in vivo).

На первом этапе используют антибиотики (тетрациклин, особенно у древесных, а так же преимущественно мурасиге-скуга, а так же ауксины и цитокинины). Преимущественно антиоксиданты применяются для подавления терпенов и полифенолов, которые выделяют хвоиные, либо вплоть до суток промывают экспланты, либо добавляют антиоксиданты в среду.

Второй этап собственно микроразмножения, когда добиваются получения максимального количества микроклонов с учетом неизбежного появления растений с ненормальным морфологией и генетикой используют так же среду мурасиге -скуга и регулятор роста. При данном культивировании с повышенным содержанием цитокининов они могут накапливаться и отравлять каллусы (кусочки растений) может быть подавлена пролифирация, а так же наблюдается обводнение побегов и ослабление укоренения. Проблема решается минимизацией цитокинина в растворе, либо чередование цикл с высоким и низким уровнем фитогормонов.

3 и 4 этапы – укоренение и адаптация к почвенным условиям, а также высадка имеют основной состав среды, уменьшение концентрацию солей и применяя среду Уайта, уменьшая концентрацию сахара и исключают цитокинин. Для стимуляции корнеобразования вводят НУК и ИМК. Укоренения побегов проводят 2 способами:

1.Выдерживают микропобеги до суток в стерильном концентрате культивируемого на агаре без гормонов или даже сразу в почвенном субстрате(импульсная обработка).

2.непосредственная культивация микропобегов до месяца на среде, содержащей ауксин или даже в гидропонике, что может значительно повысить степень укоренения и упростить его, а так же адаптировать растения к среде. Целесообразно затенять нижнюю часть культивируемых сосудов черной материей или добавляется в среду активированный уголь. Выращивание растений и каллуссов в чашках Петри, пробирках называется in vitro. Пересадка регенерантов в субстраты очень ответственное мероприятие которое приходится на весну, начало лета растения с 2-3 листьями и хорошо укоренившись осторожно извлекают из пробирок пинцетом, корни отмывают от агара, и высаживают в почвенный субстрат, предварительно простерилизованный при 85-90⁰С в течении 2 часов. Состав субстрата: торф и песок 3: 1., а так же торф – дерновая почва и перлит поровну, а также торф, песок, теозолит поровну. Растения - регенеранты выращивают в пикировочных горшочках, температурный режим в теплице 20-22⁰С, освещен, не более 5 тыс. люкс, влажность 65-90%. В домашних или лабораторных условиях горшочки накрывают стеклянными банками, которые постепенно открывают до полной адаптации через 20-30 дней после посадки хорошо укоренившихся растения подкармливают солями мурасиге-скуга. По мере роста растения рассаживают в большие емкости, а дальше используют как обычный посадочный материал. Наиболее сложным процессом является адаптация пробирочных растений в почве, поскольку нарушена деятельность устьиц, а у некоторых растений в условиях in vitro отсутствуют корневые волоски, что приводит к обезвоживанию, поглощения минеральных солей. Поэтому крайне целесообразно искусственно микоризация. Индусы предложили простой метод предотвращения обезвоживания во время пересадки в полевые условия или в грунт: листья опрыскивали 50% водяным раствором глицерина или смесью парафина с диэтиловым эфиром 1: 1. Метод помогает избежать применения тумана и обеспечить 100% приживаемость.

Методы (разновидности) МКР.

Основной метод -активация существующих меристем при снятии апикального доминирования (доминирующие верхушки).

2 пути: 1) Удаление верхушечных меристем стебля, чтобы убрать источники гармонов с последующим микрочередованием побега in vitro

2) Добавление в питательную среду цитокининов (6-БАП).

Полученные побеги отделяют от экспланта и вновь культивируют на свежеприготовленной питательной среде, стимулируют пролиферацию (деление клеток) пазушных меристем, возникают побеги более высоких порядков. Используют метод для размножения плодовых культур, ряда древесных и множества травянистых. Из 1 меристемы 105 растений в год.

2метод индукция возникающих адвентивных почек из ткани экспланта - основан на способности к регенерации любых организмов и тканей в единое целое растение. Питательная среда содержит 100% цитокинина, иногда 10% ауксина- самый распространенный метод для размножения цветов, овощей и др. Морфогенетическая активность экспланта продолжается до 4 лет, из 1 растения в год до миллиона в год.

3 метод дифференциация соматических клеток в зародышеподобные структуры, напоминающие обычные зиготические зародыши, которые получаются из экспланта. Основное отличие образовавшегося зародыша in vitro от in vivo в том, что соматический зародыш развивается из ткани экспланта асексуально вне зародышевого мешка и напоминает биполярную структуру с одновременным развитием стебля и корня.

Они проходят 3 стадии развития:

- глобулярная стадия;

- сердцевидная стадия;

-торпедовидная стадия, развивается в проросток.

Таким путем можно размножать часть древесных пород (дуб, ель…). Формирование эмбрионов происходит в 2 этапа. 1) дифферинциация клеток экспланта за счет добавления в среду ауксинов. 2) На следующей стадии сформировавшиеся клетки развиваются в эмбриоиды при отсутствии ауксинов в среде.

Соматический эмбриогенез происходит в тканях первичного экспланта и в каллусной культуре, как правило, эмбриогенез проводят в суспензионной культуре, однако при этом полностью исключается такой опасный этап как адаптация растений к среде, поскольку соматический зародыш копирует свойство настоящего. При использовании соответственной техники капсуляции эмбриоидов можно получить искусственные семена.

4 метод Дифференциация адвентивных почек в первичные пересадочные каллусные ткани. Метод используется очень редко, т.к., чреват накоплением мутаций, вплоть до полиплоидии, а также возможной низкорослостью и неправильным расположением листьев. Однако есть и положительные моменты, т.к., этот метод экономически эффективен, поскольку из каждой клетки может образоваться новое растение. Только так можно размножать растения в культуре тканей и в трех методах очень важен для селекции по хозяйственно-ценным признакам. Этот метод показан для растений со стабильной генетикой каллуса и слабой изменчивостью растений-регенерантов.

⇐ Предыдущая 1 2 3 45