Питательные среды и растворы

Для определения возможных токсических эффектов в работе применяли тест на определение токсичности по отношению к микроорганизмам. В тесте использовали Salmonella typhimuium.

Ход эксперимента:

1. За 12-15 ч. до проведения эксперимента делают пересев культуры тестерного штамма Salmonella typhimurium TA 100 с косяка в 5 мл LВ-бульона для получения " ночной" культуры.

2. 2% LВ-агар разливают в чашки Петри.

3. Делают разведения " ночной" культуры в водопроводной воде.

4. Растопленный 0.6% LВ-агар разливают стерильно по 3 мл в пробирки и ставят в водяную баню при 45°С.

В пробирки с 3 мл полужидкого 0.6% LВ-агара вносят 0.1 мл бактериальной суспензии нужного разведения и 0.1 мл раствора вещества в исследуемой концентрации (в нашем случае опытным вариантом служили облученные образцы). Раствор перемешивают и наслаивают на нижний 2% LВ-агар в чашки Петри. В контроле вместо раствора вещества добавляют 0.1 мл растворителя (в случае облучения опытных образцов добавления растворителя в контроль не требовалось). После 24ч. инкубации при 37°С подсчитывают число колоний, выросших на чашках Петри в опытном и контрольном вариантах. Для оценки степени токсичности исследуемого вещества (в нашем случае - доз облучения) используют критерий " выживаемость" тестерного штамма при действии определенной дозы вещества.

число колоний в опыте

Выживаемость = --------------------------------------- х 100%

число колоний в контроле

В нашем случае разведение культуры делали до 10^-5. Полученные результаты представлены на рисунке (число КОЕ/ч.Петри).

2.4.2 Тест Эймса (Salmonella typhimurium)

Тест Эймса получил широкое распространение при первичном выявлении генетической активности агентов различной природы. Это тест-система, разработанная в 60-е годы XX века американским исследователем Брюсом Эймсом, который длительное время изучал мутации в генах, контролирующих биосинтез гистидина у Salmonella typhimuium (Ames, 1971). В тесте Эймса используются ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimuium, которые под действием мутагенов способны ревертировать к прототрофности. Некоторые мутантные штаммы содержат мутации типа замены пар оснований (his G46), а другие – мутации типа сдвига рамки считывания (his 3052). В настоящее время тест Эймса усовершенствован: наряду с хорошо изученными мутациями потребности в гистидине в геном сальмонеллы введена делеция по одному из генов репарации (uvrB-bio), что повышает чувствительность бактерий к мутагенам. Также в геном тестерных штаммов введена rfa-мутация, блокирующая синтез липополисахаридной капсулы, для повышения проницаемости клеток. Некоторые тестерные штаммы Salmonella typhimurium содержат несут плазмиду pKM 101, содержащую гены, повышающую чувствительность клеток к агентам, усиливающим рекомбинацию ДНК и индуцирующим SOS-мутагенез. Также, благодаря данной плазмиде, клетки тестерных штаммов резистенты к ампициллину, что используется как маркер присутствия плазмиды. С применением теста Эймса впервые были показаны мутагенные эффекты огромного числа химических соединений, сигаретного пепла, некоторых пищевых консервантов, красителей для волос, образцов природных комплексов (вода, почва) и другие.

Сущность теста заключается в том, что ауксотрофные по гистидину тестерные штаммы бактерий Salmonella typhimurium культивируют на специальной среде, на которой могут расти лишь мутанты этих штаммов, у которых произошла мутация от ауксотрофности по гистидину к прототрофности. Без внешних воздействий такие мутации происходят с низкой частотой. Если в среду культивирования ввести химический мутаген, то частота мутаций значительно увеличивается, что регистрируется по числу колоний прототрофных микроорганизмов, выросших на данной селективной среде. Следует отметить, что определенным ограничением применения теста Эймса является невозможность тестирования образцов, содержащих свободный гистидин.

Метод дает возможность исследовать мутагенность как исходного препарата, так и его метаболитов. Метаболические превращения соединения происходят в слое полужидкого агара, в который вместе с культурой вносят микросомную фракцию, полученную из клеток печени крыс, предварительно обработанных индукторами монооксигеназ смешанных функций.

В работе используют набор мутантных штаммов S.typhimurium:

Ход эксперимента:

1. За 12-15 ч. до проведения эксперимента делают пересев культуры тестерного штамма с косяка в 5 мл LВ-бульона для получения " ночной" культуры. При выращивании штаммов, несущих плазмиду рКm 101, в питательный бульон вносят ампициллин в концентрации 25 мкг/мл. Культуру инкубируют при 37^оС.

2. В день постановки эксперимента 5 мл " ночной" культуры переносят в 20 мл свежего LВ-бульона с ампициллином (25 мкг/мл) и инкубируют с принудительной аэрацией при 37^оС в течение 2 – 2.5ч до достижения культуры экспоненциальной фазы роста (плотность суспензии 1-2^.10⁹ кл/мл). Затем культуру переносят в стерильные центрифужные пробирки и центрифугируют 20 мин. при 5000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 0.02М фосфатном буфере или растворе солевого концентрата, разведенном дистиллированной водой в соотношении 1: 4.

3. Растворы исследуемых препаратов готовят в стерильной дистиллированной воде или диметилсульфоксиде (ДМСО). Каждое соединение необходимо тестировать не менее чем в 5 концентрациях, отличающихся, например в 10 раз (Дурнев с соавт., 2011).

4. Контроли. Каждый эксперимент предусматривает два обязательных контроля: в качестве негативного контроля служит использованный в работе растворитель. Положительный контроль – растворы известных мутагенов. Позитивный контроль специфичен для каждого тестерного штамма. Для штаммов ТА 1535, ТА 100 – азид натрия (NaN₃) – 1.5 – 3 мкг/чашку, нитрозометилмочевина – 100 мкг/чашку. В варианте с метаболической активацией – циклофосфан (500 мкг/чашку). Для штаммов ТА 1538, ТА 98 – 2-нитрофлуорен 10 мкг/чашку. В варианте с метаболической активацией – 2-аминофлуорен (10 мкг/мл).

5. В стерильные чашки Петри разливают нижний агар.

6. В пробирки разливают 0.6% верхний агар по 3 мл с микродобавками биотина и гистидина и ставят на водяную баню при температуре 45^оС.

7. В верхний агар вносят 0.1мл бактериальной суспензии, 0.1 мл раствора исследуемого соединения, в случае с метаболической активацией – 0.5 мл микросомной активирующей смеси (МАС), содержащей кофакторы. Все перемешивают и наслаивают на нижний селективный агар. После полного застывания агара чашки переносят в термостат при 37^оС.

8. Учет результатов проводят по индукции обратных мутаций к гистидиновой прототрофности через 48ч. инкубации. Сравнивают число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения и в негативном контроле контроле.

Предложена следующая система оценки соединений на мутагенную активность [Фонштейн с соавт., 1985]:

· число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения, и в негативном контроле достоверно различается менее чем в 2.5 раза - делается заключение об отсутствии мутагенной активности;

· число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения, от 2.5 до 10 раз превышает число колоний-ревертантов в негативном контроле - исследуемое соединение обладает слабой мутагенной активностью;

· число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения, от 10 до 100 раз превышает число колоний- ревертантов в негативном контроле - исследуемое соединение обладает средней мутагенной активностью;

· число колоний-ревертантов, выросших при действии исследуемого соединения превышает спонтанный фон мутирования (негативный контроль) более чем в 100 раз – вещество обладает сильной мутагенной активностью.

В нашем случае опытными служили образцы с разными концентрациями фуранонов, контрольным – без фуранонов.