Эксцизионная репарация поврежденных оснований у E.coli.

 

Механизмы репарации:

· Восстановление исходной структуры

· Эксц репарация: вырезание оснований и нкт

· Репарация неспаренных оснований

· Пострепликативная репарация: рекомб

· Синтез ДНК в обход повреждений: SOS

Пиримидиновые димеры – фотолиазой под действием света. Деалкилирование ДНК-метил-трансферазой. Сшивание лигазой. Заполнение АП-сайтов инсертазой.

Эксц репарация:

1. ДНК-гликозилаза узнаёт повреждённое основание и удаляет его. АП-сайт

2. АП-эндонуклеаза вносит в нить разрыв.

3. Фосфодиэстераза отщепляет от ДНК сахарофосфатную группу без основания.

4. ДНК-поли 1 иниц репаративный синтез ДНК, удаляя 53 экзонук активностью часть повреждённой цепи.

5. Лигаза

 

Вопрос №58.

Эксцизионная репарация нуклеотидов у E.coli. Гены uvrA-uvrD – гены мутаторы.

 

Эксисома (UvrA-2UvrB-UvrC) узнаёт повреждённый димер, присоединяется, вносит 2 однонитевых разрыва. Фрагмент 12 нкт хеликазится (UvrD) и отсоединяется. Репаративный синтез ДНК поли 1. Лигаза.

Это гены мутаторы.

 

Вопрос №59.

Репарация неспаренных оснований у E.coli. Гены dam, mutH, mutL, mutS, uvrD – гены мутаторы.

Метилирование ДНК – метилаза Dam.

C непр основанием связывается белок MutS, с ним MutL и MutH. Тратится одна АТФ. MutH режет неметил нить по GATC с любой стороны от непр основания. ДНКхеликаза 2 (MutU=UvrD) расплетает и вытесняет нить из гетеродуплекса. Экзонуклеаза 1 (3-конец) или 7 (5-конец) удаляет кусок ок 1000. Нужны MutL b MutS. ДНКполи 3 в присутствии SSB достраивает, потом сшивка. Гены dam, mutH, mutL, mutS, uvrD – гены мутаторы.

 

Вопрос №60.

Пострепликативная рекомбинационная репарация у E.coli.

Синтез ДНК встаёт перед повреждением, продолжается после. Остаётся брешь. Из матричной цепи при участии RecA вырезается кусок, встраивается в брешь. Репаративный синтез материнской цепи ДНКполи 1 и 2. Лигаза сшивает, повреждение остаётся.

 

Вопрос№ 61.

Понятие о мутагенных индуцибельных путях репарации. SOS-репарация у E.coli и её генетический контроль. SOS-репарация и УФ-индуцированный мутагенез (почему в штаммах E.coli, дефектных по генам recA, umuC, umuD или dinB, УФ-индуцированный мутагенез отсутствует? ).

Повреждённое основание ДНК – невозможность специф спаривания оснований. Репликация блокируется. Блок обходится встраиванием неспециф оснований. RecA связ с однонитевой ДНК, образует ДНК-белковые фил-ты – акт форма RecA*, кот запускают индукцию SOS-регулона (более 40 генов). Гены umuC, umuD, dinB – продукты необходимы для репликации в обход повреждений. Частота мутаций повышается.

ДНКполи3 –(SOS-индукция)- ДНКполи5 (umuC, 2umuD’, RecA, АТФ), ДНКполи4 (DinB)

ДНКполи5 – неточная, ошибки каждые 10^-2—10^-3

В штамма, дефектных по этим генам, УФ-индуц мутагенез отсутствует.

 

Вопрос №62

Роль репарационных систем в поддержании стабильности генетического аппарата в филогенезе и онтогенезе. Нарушения в процессах репарации как причина наследственных молекулярных болезней человека.

Стабильность нужна для поддержания вида и онтогенеза. Мутации в репар генах – сверхчувствительность клеток к мутагенным факторам, повышение уровня спонт мутирования.

Пигментная ксеродема – нарушена эксц репарация. Дерматозы под действием солнца, рак кожи, неврол нарушения, дефекты роста и развития, преждевременное старение.

Трихотиодистрофия – то же. Фоточувст, ихтиоз, неврол нарушения, умст отст, дефекты роста и развития.

Синдром Блума – подавлен реп синтез, дефект хеликазы, высокая частота аберраций. Задержка роста и развития, нарушение иммунки, предрасположенность к раку и инфекциям, свето-инд поражение капилляров кожи.

Атаксия-телангиэктазия – нарушения реп 1нит, хр аберрации, чувст к мутагенам. Церебральная атаксия, нарушение иммунки, предрасположенность к раку, прогр отсталость, спонтанные хром абер.

 

Вопрос №63.

Особенности микроорганизмов как объекта генетических исследований. Основные термины: штамм, дикий тип, клон, клонирование как метод генетического анализа в культуре микроорганизмов. Признаки микробных культур, прототрофы, ауксотрофы. Методы, применяемые в генетическом анализе у бактерий и бактериофагов: клональный анализ, метод селективных сред, метод отпечатков и др.

 

Штамм – ген однородная культура данного вида, выделенная из 1 клетки и отлич от остальных культур происхождением и часто рядом признаков, несущ для систематики.

Дикий тип – штамм, выделенный из природы, типичный представитель данного вида.

Клон – группа клеток или молекул, идент клетке/молекуле, от которой они произошли. В генетике – генет однородное потомство, полученное при размножеии 1 клетки/вирусной частицы. У эукариот клон – потомство 1 клетки, делящейся митотически.

Клонирование: суспензия бактерий à по поверхности агара à каждая колония от одной клеткиà бакт клоны

Признаки микробных культуур: морфологические, физиол, биохим.

Прототроф – культуры, растущие на минимальной среде. Мин среда – набор в-в, необходимый и дост для роста организма. Ауксотроф – культуры, требующие добавки к мин среде.

Особенности микроорганизмов:

· Простая орг генома

· Гаплоидность (как правило)!!!

· Высокая скорость размножения

· Много потомков от «скрещивания»!!!

· Простые биохим признаки, сост фенотип

· Использование методов селективных сред!!!

· Однородность клеточного состава

Для выделения мутантных клонов, не способных синтезировать необходимые для своего роста вещества и в силу этого неспособных к росту на минимальной среде, анализируемую смесь клеток высевают на полную среду, и от каждой выросшей на ней колонии делают отсевы на две питательные среды: полную и минимальную. В этом случае из клеток с генотипом дикого типа, т. е. не нуждающихся для своего роста в веществах полной среды, разовьются колонии на минимальной среде. Из мутантных клеток, которые утратили свойство синтезировать какое-либо из необходимых для своего роста веществ, на минимальной среде колонии не разовьются. Таким образом, одновременная проверка клонов на двух разных средах позволяет выявить биохимические мутации.

Для облегчения пересева колоний, применяют специальную печатку, имеющую размер чашки Петри. Плоскость печатки покрывают бархатом. Сначала к печатке с бархатом прикладывают чашку с анализируемыми колониями, выросшими на полной среде. На ворсинках бархата остаются клетки отдельных колоний. Затем к этой печатке прикладывают две чашки — с минимальной и полной средой. После инкубации таких отпечатков сопоставляют колонии, выросшие на полной и на минимальной среде. Практически это делают таким образом: чашку с минимальной средой ставят на чашку с полной средой так, чтобы идентичные колонии совпали. Просматривая две совмещенные чашки в проходящем свете, на чашке с полной средой отмечают колонии, которые не выросли на минимальной среде. Это дает возможность обнаружить мутантные колонии.

 

Вопрос №64

Генетические элементы бактериальной клетки: хромосома, плазмиды, профаги, мигрирующие элементы. Организация генетического аппарата у бактерий (топология бактериальных геномов). Общее представление о плазмидах и их разнообразии. Строгий и ослабленный контроль репликации. Плазмиды конъюгативные и неконъюгативные. Мобилизация неконъюгативных плазмид. Плазмиды с узким и широким кругом хозяев.

Плазмиды – кольц мол ДНК. Способны к автономной репликации, имеют собственный ориджин репликации. Профаг – состояние фаговой ДНК при лизогении, при кот фаговая ДНК интегр в бакт хр-му или репл как плазмида. Трансп эл-ты – не сущ автономно, интегр в другие мол ДНК. У киш пал 1 кольц хр-ма, 4289 генов, 4, 6х10^6 нкт. У родобактера 2 разл кольц хр, у циано 4-218 идент и 3-8 кольц плазмид, бациллус цереус – 1 кольц хр-ма, 1 мегаплазмида, эпулописциум фишелсони – 85тыс идент хр-м, родококкус фацианс – 1 лин хр-ма, 1 лин плазмида.

ColE1 - бактериоцин, кот убивает E.coli. Источник - E.coli

Tol - деградация толуола и бензойной кислоты. Источник - pseudomonas putida

Ti - индукция опухолей у растений. Источник - agrobacterium tumefaciens

pSum - образование клубеньков на корнях бобовых. Источник - rhizobium meliloti

SCP1 - синтез антибиотика метиленомицина. Источник - streptomyces coelicolor

RK2 - устойчивость к ампицилину, канамицину и тетрациклину. Источник - klebsiella aerogenes

ColE1: неконъюгативнвная, способна к моб, узкий круг хозяев ( сем энтеробактериация), мультикопийная (до 20 копий на кл) 6646 пн

RK2: конъюгативная, широкий круг хозяев, низкая копийность. 60 тыс пн

RSF1010: устойчивость клеток к сульфаниламиду и стрептомицину. Неконъюгативная, способна к моб, широкий круг хозяев, мультикоп (до 30)

Плазмиды со строгим контролем репликации удваиваются синхронно с бактериальной хромосомой и за счет использования одних и тех же репликативных комплексов, в которых главную роль играет ДНК-полимераза III. Таких плазмид в бактериальной клетке может насчитываться от одной до трех копий в расчете на одну копию бактериальной хромосомы молек.масса которых превышает 20 МД. Репликация плазмид с ослабленным контролем происходит с участием ДНК-полимеразы I. В каждой бактериальной клетке содержится в среднем 40–50 копий таких плазмид. В связи с этим плазмиды с ослабленн. контролем репл-ции еще наз. мультикопийными. Молек.м. не более 15–20 МД.

Неконъюгативные плазмиды не содержат tra-генов, и поэтому они неспособны самостоятельно передаваться от одних клеток к другим. Неконъюгативные плазмиды – это мелкие плазмиды с молекулярной массой менее 25 МД. Однако неконъюгативные плазмиды могут быть перенесены в реципиентные клетки с помощью конъюгативных плазмид. Перенос неконъюгативных плазмид с помощью конъюгативных называется мобилизацией. При этом неконъюгативная плазмида является мобилизуемой, а конъюгативная – мобилизующей. Мобилизация может осуществляться из-за наличия в плазмидах IS-элементов и транспозонов, которые обеспечивают объединение двух плазмид друг с другом, т. е. образование коинтегратов.

 

Вопрос №65.

Процессы передачи генетической информации у бактерий: конъюгация. Структура F-фактора. Перенос конъюгативных плазмид на примере F-фактора у E.coli. Схема интеграции F-фактора в хромосому. Образование F’(прим)-факторов, сексдукция, меродиплоиды. Роль конъюгации в горизонтальном переносе генов у бактерий.

Конъюгация – процесс переноса плазмиды, иногда хром ДНК донора, из донора в реципиент при непосредственном контакте или через мостик-подобное соединение. Способность бакт быть донорами определ наличием у них коньюгативных плазмид. При конъюгации могут передаваться участки ДНК длиной сотни-млн пар оснований. F-фактор – 1 описанная плазмида. 100 тыс пн. Ок 60 генов, tra-район – 36 генов. Есть 2 IS3, IS2, Tn1000. Донор – F+, 1-3 пилей. В пилях осевой канал. Обесп контакт, потом сокр à тесный контакт. В сайт oriT плазмиды F вносится 1нит разрыв, с 5 конца в реципиент. В доноре синтезируется компл нить. В рец тоже синтезируется комплементарная нить, замыкается в кольцо.

Достройка в проц протягивания. И у нас 2 мужика. Перенос хр ДНК не происходит, высокая частота ~ 0.1 F может интегрировать в разл участки в хр-му.

Мерозигота – частичная зигота, тк при переносе хр генов клетка-донор переносит только часть своих генома. Сексдукция – перенос хром генов, обусловленный F’-фактором. Образуются при слишком большом кроссе при исключении F. Могут исп для создания частично дипл штаммов, сод 2 копии опред участка хр-мы.

Лёгкий обмен ген инфой может давать опред преимущества клеткам. Трансконъюганты – клетки, кот получили доп инфу в рез-те конъюгации. Устойчивость к антибиотикам, метабол гены.

 

Вопрос №66.

Процессы передачи генетической информации у бактерий: конъюгация. Образование и свойства Hfr-штаммов. Схема переноса хромосомных генов при конъюгации. Рекомбинация после Hfr-конъюгации.

В популяции F+ клеток плазмида инт в хр-му с низкой частотой => F+ штаммы могут с низкой частотой переносить хром маркеры в F- клетки. Если изолировать кл с инт F-плазмидой и получить чистую культуру, то такие штаммы (Hfr) передают маркеры с высокой частотой ~ 0.01

Hfr – плазмида интегрирована в хромосому. Hfr клетки имеют пили. Тесный контакт, разрыв в oriT плазмиды, в реципиент с 5-конца. В доноре синт комплементарная нить, в рец тоже, но в кольцо не замыкается. Возникает мерозигота. Рекомбинанты в рез-те 2 кросса. Реципиенты не приобретают новых способностей. Вся хромосома переносится редко из-за прерывания скрещивания. Полная копия F-фактора последней, если вообще переносится. Макс 1.5 тыс пар осн, 30 мин. Рец получает лин фрагмент 2цеп ДНК – замещение гом уч-ка. Одиночный кросс – лин хр-ма – гибель клетки.

 

Вопрос №67.

⇐ Предыдущая1234Следующая ⇒

Поделиться: