Методические указания для проведения лабораторных занятий

Методические указания для проведения лабораторных занятий

по курсу «Биохимия сельскохозяйственной продукции»

(для бакалавров технологического факультета по направлению: 35.03.07 –

Технология производства и переработки сельскохозяйственной

продукции)

 

 

Тверь, 2017

 

Составитель: к. с.-х. н., доцент кафедры агрохимии и земледелия

Шилова О.В.

Рецензент: к. б. н., доцент кафедры биологии животных, зоотехнии и основ

ветеринарии Тверской ГСХА Корецкая Е.А.

 

 

Шилова О.В. Методические указания для проведения лабораторных занятий по курсу «Биохимия сельскохозяйственной продукции» (для бакалавров технологического факультета по направлению: 35.03.07 – Технология производства и переработки сельскохозяйственной продукции) – Тверь, 2017– 69 с.

 

Председатель методической комиссии        Акимов А.А.

Введение

Цели дисциплины: формирование современных представлений, знаний и умений о превращениях веществ и энергии в живых организмах, химическом составе сельскохозяйственной продукции растительного и животного происхождения, биохимических процессах, происходящих в ней при хранении и переработке.

Задачи дисциплины: изучение строения и биологических функций важнейших органических веществ; механизмов ферментативных и биоэнергетических превращений в организмах; химического состава сельскохозяйственной продукции и биохимических процессов, происходящих в ней при хранении и переработке;

– оценка качества и технологических свойств сельскохозяйственной продукции по биохимическим показателям;

– применение знаний о химическом составе и биохимических процессах при обосновании технологий производства, хранения и переработки сельскохозяйственной продукции;

– ознакомление с современными методами и достижениями биохимической науки.

Ход работы

1. Извлечение сахаров водой

Взвесить 5 г исследуемого материала (яблоки, капуста, морковь, лук), размельчить и растереть до гомогенной массы в фарфоровой ступке с небольшим количеством воды, нагретой до 70^оС. Растертую массу количественно перенести в коническую колбу на 100 мл, объем вытяжки довести до 50 мл горячей дистиллированной водой и оставить на 10 мин для экстракции. По истечении указанного времени экстракт охладить, отфильтровать через воронку Шотта и количественно перенести вытяжку в мерную колбу. При необходимости довести объем водой до 50 мл.

Обязательно провести осветление вытяжки в случае окрашенных (мутных) экстрактов. Для этого в теплую, не доведенную до окончательного объема вытяжку добавить по каплям 10 % раствор уксуснокислого свинца до прекращения образования осадка. Обычно на вытяжку, полученную из навески 10 г, необходимо добавить 0, 5-2 мл раствора уксуснокислого свинца. Избытка соли свинца следует избегать, так как он проходит через фильтр и мешает ходу анализа. Осветленную вытяжку отфильтровать и довести объем водой до 50 мл.

2. Определение восстанавливающих сахаров

Для определения содержания восстанавливающих сахаров предварительно следует приготовить раствор глицерата меди. Для этого необходимо сделать смесь (2: 1) растворов № 1 (0, 8 % CuSO₄ · 5H₂O) и № 2 (15 % NaOH с добавлением 1 мл глицерина).

Отобрать 1 мл осветленной отфильтрованной вытяжки в пробирку, добавить 15 мл глицерата меди, перемешать и нагревать на водяной бане при

70^оС 6 мин. Затем пробирку охладить в холодной воде и отобрать прозрачную жидкость в кювету для определения оптической плотности раствора (проба 1).

3. Определение суммы восстанавливающих и невосстанавливающих сахаров (сахарозы)

Для определения содержания невосстанавливающих сахаров отобрать 0, 5 мл осветленной отфильтрованной вытяжки, добавить 0, 5 мл 1 % НСl, перемешать и поставить на кипящую водяную баню на 15 мин. По истечении указанного времени добавить 15 мл глицерата меди и нагревать на водяной бане ровно 6 мин. Охладить пробирку в холодной воде, дать вытяжке отстояться и отобрать прозрачную жидкость для оптического анализа (проба 2). В этой пробе определяется сумма восстанавливающих сахаров и сахарозы.

4. Спектрофотометрия

Оптическую плотность исследуемых растворов необходимо регистрировать на спектрофотометре при длине волны λ = 582 нм.

Содержание сахаров в пробах можно определить по калибровочной кривой, построенной по глюкозе. Для этого необходимо приготовить 50 мл раствора, содержащего 10 мг/мл глюкозы, и затем методом разбавления получить остальные растворы согласно таблице:

№	Содержание глюкозы, мг/мл	Количество ис- ходного раствора глюкозы, мл	Количество воды, мл	Оптическая плотность, D582
1 2 3 4 5 6	0, 5 1, 0 2, 5 5, 0 7, 5 10, 0	0, 5 1, 0  2, 5  5, 0  7, 5 10, 0	9, 5 9, 0 7, 5 5, 0 2, 5 0

 

Для определения оптической плотности ( D₅₈₂) этих растворов предварительно провести реакции с глицератом меди, аналогично опытным образцам.

Количество восстанавливающих сахаров в исследуемом объекте (А, %) вычислить по формуле:

где с - содержание сахаров в пробе 1, найденное по калибровочной кривой; V - объем вытяжки, полученной из навески; m - масса навески в граммах.

По этой же формуле рассчитать сумму восстанавливающих сахаров и сахарозы, подставляя вместо с содержание сахаров в пробе 2, найденное по калибровочной кривой. Разность между вторым и первым определениями, умноженная на коэффициент 0, 95, дает содержание сахарозы в исследуемом объекте.

Результаты оформить в таблицу.

Объект	D582 проба 1	D582 проба 2	Количество вос- станавливающих сахаров, мг/г	Сумма моно- и олигосахаридов, мг/г	Количество сахарозы, мг/г

Сделать выводы.

Контрольные вопросы

1. Классификация углеводов.

2. Основные моносахариды растений, их свойства и функции.

3. Основные дисахариды растений – сахароза, мальтоза, целлобиоза. Функции сахарозы в растениях.

4. Редуцирующие веществами – особенности строения и обнаружения их в растительном материале. Приведите примеры.

5. Нередуцирующие веществами – особенности строения и обнаружения их в растительном материале. Приведите примеры.

6. Использование растительных углеводов в пищевой промышленности.

Тема 2. Состав, строение и биологические функции углеводов и липидов

Лабораторная работа № 3. Определение кислотного и йодного числа

растительных жиров

Учебные вопросы:

1.Строение и химические свойства липидов

2.Физиологическая роль липидов для растений

3.Обмен липидов в растениях

 

Запасные жиры растений представляют собой сложные эфиры многоатомных спиртов (в первую очередь, глицерина) и жирных кислот – триглицериды. Этерификация глицерина может осуществляться как одним типом жирных кислот, так и разными, причем последний вариант наиболее распространен. В том случае, когда все три кислоты насыщенные, образуются твердые жиры, если кислоты ненасыщенные – жидкие. Растительные жиры чаще всего жидкие, поэтому их именуют маслами.

Для жиров (как жидких, так и твердых) характерна высокая степень гидрофобности. Они не растворимы в воде, но хорошо растворимы в углеводородах, галагеналканах, спиртах, эфирах.

В числе компонентов, входящих в состав растительных масел, всегда присутствует небольшое количество свободных жирных кислот. Этот показатель именуется кислотным числом и дает представление о количестве свободных жирных кислот в масле. В частности, кислотное число показывает, сколько мг КОН необходимо для нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г масла.

Поскольку при длительном хранении масла происходят процессы окисления, то содержание свободных жирных кислот со временем увеличивается. Следовательно, кислотное число является важным показателем качества жира.

Другим физико-химическим показателем, характеризующим свойства жира, является число омыления, которое показывает количество мг КОН, необходимое для омыления связанных и нейтрализации свободных жирных кислот в 1 г масла.

О содержании ненасыщенных жирных кислот в жире судят по йодному числу – количеству граммов йода, присоединившемуся к 100 граммам жира. Определение физико-химических показателей растительного масла имеет важное значение, так как позволяет контролировать качество получаемого масличного сырья и его изменение при переработке и хранении.

Цель настоящей работы – определить и сравнить физико-химические свойства различных растительных масел.

Реактивы и материалы: подсолнечное, рапсовое, оливковое масло, этиловый спирт, КОН, H₂SO₄, фенолфталеин, хлороформ, 2, 5 % спиртовой раствор иода, гипосульфит натрия, крахмал, дистиллированная вода, конические колбы, весы, микробюретка для титрования, водяная баня, обратный холодильник.

Ход работы

1. Определение кислотного числа

Взвесить пустую колбу, затем осторожно туда добавить небольшое количество растительного масла (оливковое, подсолнечное, рапсовое). Массу навески определить по разности массы колбы с маслом и пустой колбы.

Приготовить 100 мл 0, 2 н спиртового раствора КОН. Для этого взвесить 1, 12 г щелочи и растворить в минимальном количестве воды (1-1, 5 мл). После того как навеска щелочи растворена, довести объем 96 % этанолом до 100 мл.

В колбу с маслом прилить 15 мл этанола, добавить 2-3 капли фенолфталеина и тщательно перемешать. Затем оттитровать полученный раствор 0, 2 н спиртовым раствором щелочи до появления окрашивания. Титрование более слабыми растворами КОН не дает видимых изменений окраски и затрудняет определение конца титрования. В качестве контроля оттитровать 15 мл этанола с 2-3 каплями фенолфталеина тем же раствором щелочи.

Кислотное число (КЧ) вычислить по формуле:

где T - титр щелочи (количество КОН в 1 мл раствора), мг; V - объем раствора щелочи, пошедшей на титрование контрольной пробы, мл; V_I - объем раствора щелочи, пошедшей на титрование опытной
пробы, мл; m - масса навески в граммах.

2. Определение числа омыления

В конической колбе взвесить навеску масла 0, 2-0, 5 г (как указано выше), прилить 15 мл 0, 2 н спиртового раствора щелочи и нагревать на водяной бане 30 мин с обратным холодильником. Одновременно прокипятить контрольную пробу с таким же количеством щелочи, но не содержащую масла. По истечении указанного времени охладить колбы с раствором. При полном омылении на опытной колбе не должно быть блестящих капелек масла, в противном случае омыление надо продолжить. После омыления и охлаждения в колбы добавить 2-3 капли фенолфталеина и избыток щелочи оттитровать 0, 5. раствором H₂SO₄, пользуясь микробюреткой.

Вычислить число омыления (ЧО) по формуле:

где T - титр щелочи, мг; V - объем кислоты, пошедшей на титрование контрольной пробы, мл; V₁ - объем кислоты, пошедшей на титрование опытной пробы, мл; m - масса навески в граммах.

3. Определение йодного числа

В коническую колбу взвесить 0, 1 грамм жира и внести 5 мл хлороформа. Для контроля взять колбу, содержащую только 5 мл хлороформа. В обе колбы прилить по 10 мл 2, 5 % спиртового раствора иода, закрыть пробкой, тщательно перемешать и оставить в темной месте на 1 ч при комнатной температуре. По истечении указанного времени избыток иода оттитровать 0, 1 н раствором гипосульфита натрия до желтой окраски. Затем добавить 1 мл 1 % раствора крахмала и продолжить титрование до обесцвечивания раствора. Иодное число (ИЧ) вычислить по формуле:

где T - титр 0, 1 н раствора гипосульфита натрия, мг; V - объем раствора гипосульфита, пошедшего на титрование контрольной пробы, мл; V ₁ - объем раствора гипосульфита натрия, пошедшей на титрование опытной пробы, мл; m - масса навески в граммах; 0, 0127 - количество йода (г), эквивалентное 1 мл 0, 1 н раствора гипосульфита натрия.

Результаты оформить в виде таблицы.

Вид растительного масла	Кислотное число	Число омыления	Йодное число

Сделать сравнительный анализ полученных результатов.

4.Определение перекисного числа

Вприсутствии кислорода воздуха кислоты, входящие в состав жиров, могут частично окисляться и образовы­вать перекиси. Это явление наблюдается при порче жи­ров, а также при их высыхании. Таким образом, перекис-ное число служит показателем окислительных изменений жиров.

Обычно перекисное число, как и йодное число, выра­жается в граммах йода, которое может прореагировать с активным водородом перекисей, содержащихся в 100 г жира.

Принцип метода.Определение перекисного числа ос­новано на том, что перекиси жира в кислой среде спо­собны реагировать с йодистым калием, выделяя из него йод.

Выделяющийся йод оттитровывают раствором гипо­сульфита:

2Na₂S₂О₃ + J₂ → 2NaJ + Na₂S₄О₆

и по количеству гипосульфита, затраченному на связы­вание выделившегося йода, вычисляют перекисное число.

Ход работы

1. На аналитических весах отвешива­ют 2 –3 г жира, который помещают в коническую колбу емкостью 150–200 мл. В другую колбу (контроль) на­ливают 2–3 мл воды.

2. В обе колбы наливают по 10 мл хлороформа и растворяют жир.

3. В  колбы добавля­ют по 20 мл ледяной уксусной кислоты и по 1 мл свеже­приготовленного насыщенного раствора йодистого ка­лия.

4. Смесь тщательно перемешивают и оставляют на 3 минуты.

5. Проводят титрование выделившегося йода 0, 01 н. раствором гипосульфита. Титруют до появления желтой окраски.

6. Затем в колбы прибавляют по 1 мл 1%-ного раствора крахмала и титруют до исчезновения голубой окраски.

Вычисление результатов можно проводить по следу­ющей формуле:

х = _(а - б) · Т · 0, 001269 · 100

Н

где х – перекисное число;

а – количество миллилитров 0, 01 н. гипосульфита, израсходованное на титрование йода, выделив­шегося в результате реакции жира с йодистым калием;

б – количество миллилитров 0, 01 н. гипосульфита, израсходованное в контрольном определении;

Т – поправка к титру раствора гипосульфита;

Н – навеска жира.

Контрольные вопросы

1. Строение, свойства и функции липидов в живой клетке.

2. Жирные кислоты в составе липидов, их влияние на качество пищевых

продуктов.

3. Особенности обмена липидов растений.

4. Глиоксилатный цикл.

5. Содержание жиров в семенах и плодах культурных растений.

6. Свойства основных растительных масел.

7. Сравнительный анализ растительных и животных жиров.

8. Использование липидов в пищевой промышленности?

Ход работы

1. Выделение суммарных белков из семян зерновых и зернобобовых растений

Навеску 1 г сырых проросших семян (пшеница, ячмень, фасоль, горох, люпин, соя) поместить в фарфоровую ступку. Добавить небольшое количество кварцевого песка и тщательно растереть с 40 мл фосфатного буфера (рН 8), содержащего 0, 2 % бисульфита натрия и несколько капель этилового спирта. При использовании сухих семян их необходимо предварительно размолоть до состояния муки, и после добавления фосфатного буфера настоять в течение часа.

Для приготовления 0, 1 М фосфатного буфера с рН 8, 0 необходимо взять 95 мл 0, 2 М раствора Na₂HPO₄ · 2H₂O добавить 5 мл 0, 2 М раствора NaH₂PO₄ · H₂O и довести объем водой до 200 мл.

Гомогенат количественно перенести в коническую колбу на 100 мл и довести объем фосфатным буфером до 50 мл. Содержимое колб перемешивать на ротаторе в течение 1 ч. По истечении указанного времени колбы достать из ротатора и дать вытяжке отстояться в течение 15 мин. Затем при помощи пипетки из верхней части гомогената осторожно отобрать 10 мл раствора и перенести в центрифужные пробирки. Провести центрифугирование раствора в течение 15 мин при 3000 об/мин при комнатной температуре. По окончании центрифугирования из пробирок отобрать пипеткой 1 мл надосадочной жидкости и перенести в другую пробирку. Туда же необходимо добавить 9 мл фосфатного буфера с рН 8, тщательно перемешать, после чего раствор суммарных белков готов к спектрофотометрированию.

2. Спектрофотометрический метод определения суммарных белков

Раствор белков налить в кварцевую кювету и определить его оптическую плотность при 280 и 260 нм (в качестве раствора сравнения использовать исходный раствор фосфатного буфера). Ароматические аминокислоты тирозин и триптофан, содержащиеся в белках, поглощают свет в области λ = 280 нм. Однако поглощение в этой области имеют и нуклеиновые кислоты, хотя максимум поглощения последних составляет λ = 260 нм. Поэтому для определения концентрации белка в растворах названным методом используют уравнение Варбурга - Христиана:

с = 1, 55 × D ₂₈₀ - 0, 76 × D ₂₆₀

где с - содержание белка в мг/мл; D ₂₈₀ и D₂₆₀ - оптическая плотность растворов при 280 и 260 нм; 1, 55 и 0, 76 - расчетные коэффициенты.

Содержание суммарных белков в навеске семян (мг/г сухой массы) рассчитать по формуле:

 

где c - содержание белка в растворе, найденное по формуле Варбурга - Христиана; V - объем вытяжки в мл; m - масса навески в граммах;

10 - коэффициент, учитывающий разведение вытяжки; 86 - сухая масса воздушно-сухой массы навески семян, %; 60 - сухая масса проросших семян, %.

 

Результаты оформить в виде таблицы.

Культура	Масса навески, г	Объем вытяжки, мл	Оптическая плотность		Концентрация белка в пробе, мг/мл	Концентра- ция белка в растении, мг/г
			D 280	D260

 

Сделать сравнительный анализ полученных результатов.

3. Выделение белков из вегетативных органов растений

Взвесить навеску 0, 5 г свежего растительного материала (листья ячменя, клевера, клубни картофеля), измельчить и растереть в фарфоровой ступке с 4-кратным (по массе) количеством фосфатного буфера с рН 8, содержащим 0, 2 % бисульфида натрия и несколько капель этилового спирта. Гомогенат залить 10 мл холодной 5 % ТХУ, тщательно перемешать и поместить в холодильник на 20 мин. Затем гомогенат перенести в центрифужные пробирки и центрифугировать в течение 15 мин при 6000 об/мин для осаждения белков. После центрифугирования надосадочную жидкость слить. Осадок промыть охлажденным 96 % этанолом до полного исчезновения зеленой окраски в надоса-дочной жидкости. Повторить центрифугирование и к промытому осадку добавить 2 мл 0, 5 н NaOH. Поместить пробирки на 5 мин на кипящую водяную баню, после чего прилить еще 5 мл 0, 5 н NaOH, перемешать и центрифугировать 10 мин при 6000 об/мин. Надосадочную жидкость перенести в мерный цилиндр и измерить общий объем щелочного гидролизата. Количество белка в пробе определить по методу Лоури.

4. Определение белков по методу Лоури

Для определения содержания белков по методу Лоури необходимо предварительно приготовить растворы:

А - 2 % Na₂CO₃ в 0, 1 н NaOH;

B - 0, 5 % CuSO₄ · 5H₂O в 1 % K-Na-виннокислом;

C - смесь растворов А и В (50: 1 по объему);

Е - реактив Фолина.

Отобрать 1 мл щелочного гидролизата, добавить 5 мл раствора С, перемешать и через 10 мин добавить 0, 5 мл раствора Е. Смесь выдержать в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего измерить оптическую плотность раствора при 750 нм на спектрофотометре. В качестве раствора сравнения использовать смесь: 1 мл 0, 5 н NaOH, 5 мл раствора С и 0, 5 мл реактива Фолина.

Для определения содержания белка в растворе необходимо построить калибровочный график по альбумину или казеину.

На аналитических весах взвесить 100 мг альбумина и растворить в 100 мл фосфатного буфера. Из этого стандартного раствора приготовить производные растворы с содержанием белка от 0, 05 до 1, 0 мг/мл согласно таблице:

 

№	Содержание белка, мг/мл	Стандартный раствор альбумина, мл	Фосфатный буфер, мл	Оптическая плотность, D750
1	0, 05	0, 5	9, 5
2	0, 1	1, 0	9, 0
3	0, 2	2, 0	8, 0
4	0, 3	3, 0	7, 0
5	0, 4	4, 0	6, 0
6	0, 5	5, 0	5, 0
7	1, 0	10	0

 

Последовательно отобрать 1 мл каждого из растворов альбумина, перенести в чистые предварительно пронумерованные пробирки и добавить, как и в случае опытных растворов, 5 мл раствора С, а через 10 мин 0, 5 мл раствора Е. Содержимое каждой из пробирок осторожно перемешать и оставить при комнатной температуре на 30 мин. По истечении указанного времени измерить оптическую плотность растворов при длине волны λ = 750 нм.

По данным, полученным для стандартных растворов, построить калибровочный график (на оси ординат – величина оптической плотности, на оси абсцисс – концентрация белка).

Пользуясь калибровочной кривой найти концентрацию белка в исследуемом растворе. Общее содержание белка в вегетативной части растения (мг/г сырой массы) рассчитать с учетом где с – концентрация белка в исследуемом растворе в мг/мл; V – объем щелочного гидролизата в мл; m – масса навески растительного материала в граммах.

Результаты оформить в виде таблицы.

Культура	Масса навески, г	Оптическая плотность, D750	Содержание белка в растворе, мг/мл	Содержание белка в растении, мг/г

Сделать выводы.

Контрольные вопросы

1. Протеиногенные и непротеиногенные аминокислоты.

2. Биосинтез и функции непротеиногенных аминокислот.

3. Особенности строения белков и их физиологическая роль в живой клетке.

4. Белки семян и листьев растений.

5. Особенности белкового состава зерновых и зернобобовых культур.

6. Способы обнаружения белка в неизвестном объекте.

7. Проблемы, связанные с изучением растительных белков.

Ход работы

Для количественного определения восстановленной аскорбиновой кислоты взять навеску свежего растительного материала массой 5 г, измельчить и перенести в фарфоровую ступку. Залить сырье 10 мл 2 % метафосфорной или 1 % щавелевой кислоты и быстро растереть. Гомогенат количественно перенести в мерную колбу на 100 мл, объем довести до метки той же кислотой. Содержимое колбы тщательно перемешать, после чего профильтровать или отцентрифугировать 10 мин при 1000 об/мин.

Из фильтрата взять три пробы по 10 мл и перенести в чистые пробирки. К каждой пробе добавить 1 мл свежеприготовленного 0, 025 % раствора 2, 6-дихлорфенолиндофенола. Для приготовления этого раствора необходимо взять 0, 0625 г 2, 6-дихлорфенолиндофенола и растворить в 250 мл теплой (45 °С) дистиллированной воды, добавить 6 капель 0, 01 н. щелочи.

Если при добавлении 1 мл 2, 6-дихлорфенолиндофенола растительная вытяжка полностью обесцвечивается (это наблюдается при значительном количестве аскорбиновой кислоты в исследуемом объекте), то ее нужно разбавить в 2 раза метафосфорной кислотой.

После добавления 2, 6-дихлорфенолиндофенола к растительному экстракту включить секундомер, содержимое пробирки тщательно перемешать и быстро залить раствор в кювету толщиной 10 мм.

Через 35 секунд определить оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны λ = 530 нм. В качестве раствора сравнения использовать смесь метафосфорной кислоты и 2, 6-дихлор-фенолиндофенола (10: 1).

Изменение в интенсивности окрашивания опытного образца про-порционально количеству аскорбиновой кислоты, находящейся в рас-тительной вытяжке. Количественный расчет произвести по калибровочной кривой.

Для построения калибровочной кривой необходимо: приготовить стандартный раствор аскорбиновой кислоты концентрацией 1 мг/мл, для этого взвесить 100 мг аскорбиновой кислоты и растворить в 100 мл 2 % метафосфорной кислоты;

– из стандартного раствора приготовить разведения, содержащие от 1 до 100 мкг/мл аскорбиновой кислоты, согласно таблице;

– отобрать 10 мл каждого из растворов аскорбиновой кислоты, перенести в чистые предварительно пронумерованные пробирки, добавить 1 мл 2, 6-ди

хлорфенолиндофенола и определить оптическую плотность этих растворов.

 

 

№	Содержание аскорбиновой кислоты, мкг/мл	Количество стандартного раствора, мл	Количество воды, мл	Оптическая плотность раствора, D530
1	1	1	999
2	5	1	199
3	10	1	99
4	20	2	98
5	50	5	95
6	100	10	90

Пользуясь калибровочной кривой, найти концентрацию аскорбиновой кислоты в вытяжке. Количество аскорбиновой кислоты в исследуемом материале (мгк/г сырой массы) вычислить по формуле:

где с – содержание аскорбиновой кислоты в 1 мл вытяжки, найденное по калибровочной кривой; V – объем экстракта в мл; m – масса исследуемого материала в граммах.

Результаты представить в виде таблицы.

Объект исследования	Масса навески, г	Оптическая плотность раствора, D530	Количество аскорбиновой кислоты в вытяжке, мкг/мл	Количество аскорбиновой кислоты в объекте, мкг/г

Сделать анализ полученных результатов.

Определение витаминов В₁ и В₂ в растениях

В растениях содержание витаминов невелико. Вместе с тем отдельные органы и ткани растений способны в большей степени накапливать их в своем составе. Так, овощные и плодовые культуры характеризуются высоким содержанием каротиноидов, витамина Р, аскорбиновой и фолиевой кислотой. В семенах злаковых и зернобобовых культур много рибофлавина, тиамина, ниацина. В зеленых листьях растений накапливаются филлохиноны.

Тиамин, или витамин В₁, в виде тиаминпирофосфата входит в состав окислительных декарбоксилаз кетокислот. Методы определения тиамина основаны на его спектральных свойствах. Максимум поглощения тиамина составляет λ = 250 нм. Продукт окисления тиамина красной кровяной солью в щелочной среде – тиохром флюоресцирует при ультрафиолетовом освещении.

Рибофлавин, или витамин B₂, идентифицирован в природных объектах в виде четырех форм, одна из которых свободный рибофлавин, остальные связаны с нуклеотидами (флавинмононуклеотид, флавинадениндинуклеотид) и с белком. Рибофлавин входит в состав простетической группы флавиновых ферментов, осуществляющих реакции дегидрирования. Окисленная форма рибофлавина так же, как и тиамина, способна флюоресцировать в ультрафиолетовом свете. Максимум поглощения рибофлавина лежит в области λ = 225 нм.

Цель работы – качественное и количественное определение витаминов B₁ и B₂ в вытяжках из вегетативных частей растений, корнеплодов и плодов.

Реактивы и материалы: 0, 1 н. раствор H₂SO₄, 10 % трихлоруксусная кислота (ТХУ), 15 % раствор NaOH, 1 % раствор красной кровяной соли K₃[Fe(CN)₆], бромид тиамина (хлорид тиамина), рибофлавин, Na₂S₂O₄ • H₂O либо NaBH₄, 0, 01 н. раствор NaOH, металлический цинк, пепсин либо трипсин, изоамиловый спирт, изобутиловый спирт, этиловый спирт, диэтиловый эфир, дистиллированная вода, фарфоровые ступки с пестиками, конические колбы объемом 100 мл, водяная баня, мерные цилиндры, пробирки, делительные воронки объемом 50 мл, бумажные фильтры, термостат, центрифуга, флюоресцентный спектрофотометр.

Ход работы

1. Извлечение витаминов

1. К навеске измельченного растительного материала массой 10–20 г прилить небольшое количество (2–5 мл) 0, 1 н. раствора Н₂SO₄, после чего все тщательно растереть в ступке.

2. Растертую массу поместить в коническую колбу на 100 мл, сюда же прибавить 30 мл 0, 1 н. раствора Н₂SO₄. Содержимое колбы следует выдержать в течение 20 минут на кипящей водяной бане для экстрагирования витаминов.

3. После завершения процедуры экстрагирования смесь охладить и добавить в колбу 30 мг пепсина либо трипсина для перевода витамина в свободное состояние.

4. Объем гомогената довести до 50 мл раствором серной кислоты. Провести ферментацию в течение 20 ч. в термостате при 38 º С.

5. По истечении указанного времени вытяжку центрифугировать при 5000 об/мин и отфильтровать под вакуумом. К получившейся надосадочной жидкости прилить равный объем 10 % ТХУ и выпарить до 10 мл. Продолжить выпаривание вытяжки, удаляя избыток ТХУ 2-3-кратным промыванием смесью этилового спирта и диэтилового эфира (1: 1), до объема 5 мл.

Далее полученную вытяжку разделить на две части: одна идет на определение тиамина, а вторая – рибофлавина.

2. Получение тиохрома

1. В делительные воронки объемом 50 мл налить 2, 5 мл полученной вытяжки. В одну из воронок (контрольную) прилить 1, 5 мл 15 % раствора NaOH, перемешать и добавить 6 мл изобутилового спирта.

2. В опытные воронки прибавить по 1, 5 мл 0, 04 % раствора красной кровяной соли в 15 % растворе NaOH, все содержимое перемешать и прилить 6 мл изобутилового спирта.

3. Делительные воронки закрыть пробками и сильно встряхивать в течение 1 мин. Дать смеси отстояться, затем нижний слой следует слить. Для просветления спиртового слоя прилить 1 мл этилового спирта, встряхнуть, дать отстояться и полученный прозрачный раствор слить в пробирку для последующего спектрофотометрического анализа.

3. Флюоресцентная спектроскопия растворов тиохрома и рибофлавина

1. Полученные опытные растворы тиохрома перелить в кюветы и провести измерение интенсивности флюоресценции (длина волны возбуждения λ = 250 нм). Максимум флюоресценции для тиохрома составляет λ = 495-500 нм.

Аналогично провести процедуру измерения интенсивности флюоресценции для растворов рибофлавина (длина волны возбуждения равна λ = 225 нм). Регистрировать максимум флюоресценции рибофлавина в области λ = 525-530 нм.

Учитывая, что спектральные свойства окисленных и восстановленных форм тиамина и рибофлавина изменяются, провести их сравнительный флюоресцентный анализ. Рибофлавин окисляется 4 % раствором перманганата калия, который добавляется к вытяжке по каплям до исчезновения красноватой окраски, либо концентрированной HCl в присутствии металлического цинка. Восстановление окисленных форм тиамина и рибофлавина осуществить либо гидросульфитом натрия (Na₂S₂O₄ • H₂O) либо боргидридом натрия (NaBH₄), добавляя эти восстановители в количестве 0, 1–0, 2 г на 1–2 мл раствора витаминов.

Результаты оформить в виде таблицы и сделать выводы.

Витамин	Возбуждение флюоресценции, нм		Интенсивность флюоресценции, отн. ед.
	окисленная форма	восстановленная форма	окисленная форма	восстановленная форма
В1
В2

4. Количественное определение витаминов В₁ и В₂

Для количественной оценки содержания витаминов в растительных образцах следует получить калибровочные графики зависимости интенсивности флюоресценции от концентрации. С этой целью необходимо:

1. Приготовить стандартные растворы витаминов тиамина и рибофлавина (10 мг тиамина бромида (тиамина хлорида) растворить в 100 мл 0, 01 н. раствора HCl, 10 мг рибофлавина растворить в 100 мл 0, 01 н. раствора NaOH).

2. Провести окисление стандартного раствора тиамина. Для этого в делительную воронку налить 1 мл рабочего раствора и прибавить 4 мл воды.

(Рабочий раствор приготовить непосредственно перед окислением. Для этого взять 1 мл стандартного раствора и довести его до 100 мл дистиллированной водой 1 мл этого рабочего раствора будет содержать 1 мкг тиамина бромида).

3. В воронку прилить щелочной раствор красной кровяной соли и провести процедуру разделения и просветления растворов, как это описано выше. Окисленный и просветленный раствор перелить в пробирки для флюориметрии.

4. Приготовить рабочий раствор рибофлавина. Для этого следует взять 1 мл стандартного раствора рибофлавина и довести его до 100 мл дистиллированной водой (1 мл этого раствора будет содержать 1 мкг рибофлавина).

5. Построить калибровочные кривые для растворов тиохрома и рибофла-вина, взяв следующие концентрации для тиамина – 0, 05; 0, 1; 0, 15; 0, 2 мкг, а для рибофлавина – 0, 005; 0, 010; 0, 020; 0, 05 мкг.

По калибровочным кривым рассчитать содержание тиамина и рибофлавина (мкг/мл) в растительных образцах. Количество витаминов в исследуемом материале (мгк/г сырой массы) вычислить по формуле:

где с – содержание витамина в 1 мл вытяжки, найденное по калибро-вочной кривой; V – объем экстракта в мл; m – масса исследуемого материала в граммах.

Сделать выводы.

Контрольные вопросы

1. Содержание жиро- и водорастворимых витаминов в растительных продуктах.

2. Строение, свойства и функции витаминов в растениях.

Ход работы

1. Навеску в 1 г корня хрена, редьки или корнеплодов других растений растирают в ступке с кварцевым песком и затем водой количественно перено­сят в посуду на 10 мл и объем вытяжки доводят до мет­ки.

2. Вытяжку фильтруют через складчатый фильтр.

3. В колбу на 25 мл наливают 2 мл 1 %-ного раствора бен­зидина, 2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода и 1 мл приготовленного ферментного препарата; содержимое колбочки перемешивают и оставляют стоять 3 минуты (по песочным часам).

4. Через 3 минуты в колбу прибавля­ют 10 мл 30%-ного раствора NaOH и перемешивают.

Выпавшее в осадок окрашенное соединение растворяют прибавлением 10 мл абсолютного спирта, а затем полу­ченный раствор колориметрируют по стандартному ра­створу.

Стандартный раствор готовят в мерной колбе на 25 мл. В колбу наливают 2 мл 1 %-ного раствора бензи­дина и 3 мл 0, 01 н. раствора КМnO₄.

Через 10 минут, когда появившаяся сначала зеленая окраска превратит­ся в темно-красную, прибавляют 10 мл 30%-ного рас­твора NaOH и 10 мл абсолютного спирта.

Вычисление результатов.За единицу пероксидазы принимают такую ее активность, при которой препарат пероксидазы за 3 минуты дает окрашивание, равное стандарту.

 Активность пероксидазы (С) в принятых единицах на 1 г растительной ткани будет равна:

С = h ₁ ^. 10

   h₂

где h₁ – толщина слоя образцового раствора; h₂ – толщина слоя испытуемого раствора.

12345678910Следующая ⇒

Поделиться: