Тема 4. Ферменты. Состав, строение и биологические функции

Лабораторная работа №5. Определение активности: пероксидазы, каталазы, аскорбатоксидазы и

       тирозиназы. Определение гидролитической активности липазы.

Учебные вопросы:

1. Строение, свойства ферментов

2. Классификация ферментов

Ферменты – биологические катализаторы белковой природы, образуемые любой живой клеткой и обладающие способностью активизировать различные химические соединения.

Механизм действия ферментов, как и всех других катализаторов, связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции, направляя ее обходным путем через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньшей энергии активации

Все ферменты разделяют на два большие класса: однокомпонентные и двухкомпонентные.

К первому классу относятся ферменты, состоящие только из белка, обладающего каталитическими свойствами, а ко второму классу - ферменты, которые состоят из белка и связанной с ним небелковой части, так называемой активной группой. Для названия активных групп двухкомпонентных ферментов часто используют термин кофермент, или простетическая группа. У однокомпонентных ферментов роль активных групп выполняют определенные химические группировки, входящие в белок. Эти группировки получили название активных или каталитических центров.

Одним из свойств ферментов, отличающихся от свойств неорганических катализаторов, является их большая лабильность - зависимость от ряда воздействий: концентрации водородных ионов, температуры, окислительно­восстановительных условий, концентрации некоторых соединений (продуктов обмена веществ), ионов металлов и т.п.

Вторая весьма существенная особенность каталитического действия ферментов состоит в том, что оно строго специфично, то есть действие ферментов направлено на совершенно определенные химические связи.

На всех этапах переработки зерна в муку, в процессе его хранения, а также при приготовлении теста и выпечке хлеба, в большей или меньшей степени проявляется активность гидролитических и окислительных ферментов, оказывающих существенное влияние на качество продукта.

В зерне ферменты содержатся в тканях зародыша, алейронового слоя и эндосперма. Это характерные для живых растительных клеток ферменты, обуславливающие специфические функции в процессах обмена веществ.

Из множества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглись лишь те, которые оказывают или могут оказать воздействие на качество продуктов переработки зерна. К ним относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы, полифенолоксидазы и др. Наряду с этим было установлено, что некоторые ферменты зерна могут являться хорошими индикаторами его физиологического состояния. Так, каталаза, являясь очень термолабильной, хорошо отражает понижение всхожести при сушке семенного зерна, и ее активность может служить индикатором для контроля процесса сушки.

Исключительно велико биологическое значение амилаз при созревании и прорастании зерна, а также в ряде технологических процессов пищевых производств, имеющих в своей основе гидролитические превращения крахмала под влиянием амилаз зерна.

В зерне злаковых культур содержится два специфических фермента, обусловливающих гидролиз крахмала, а именно:

1) α –1, 4–глюкангидролаза или α –амилаза, гидролизующая α –1, 4–глюкановые связи крахмала и родственных ему полисахаридов, причем эти связи разрываются беспорядочно;

2) α –1, 4–глюканмальтогидролаза или β –амилаза, гидролизующая α –1, 4–глюкановые связи в полисахаридах, последовательно отщепляя остатки мальтозы от нередуцирующих концов цепей.

Несмотря на то, что протеазы имеют не менее важное значение для технологии, они изучены значительно меньше, чем амилазы. Причина этого заключается в том, что классические методы изучения протеаз животного происхождения (ферментов, гидролизующих белки) оказались малоэффективными при изучении протеолитических ферментов зерна злаков. Под влиянием протеаз происходят разжижение клейковины, что, в свою очередь, приводит к ухудшению качества выпекаемого хлеба.

Липазы вызывают гидролиз жиров, т.е. расщепляют сложные эфиры глицерина с образованием свободных жирных кислот, в результате чего повышается кислотность зерна и муки.

При участии липоксигеназ происходит окисление непредельных жирных кислот, образуются низкомолекулярные карбонильные и карбоксильные соединения, обладающие неприятным запахом и горьковатым вкусом. Этот процесс называют прогорканием жиров (муки).

Механизм действия ферментов, как и всех других катализаторов, связан со снижением энергии активации, необходимой для прохождения химической реакции, направляя ее обходным путем через промежуточные реакции, которые требуют значительно меньшей энергии активации.

На всех этапах переработки зерна в муку, в процессе его хранения, а также при приготовлении теста и выпечке хлеба, в большей или меньшей степени проявляется активность гидролитических и окислительных ферментов, оказывающих существенное влияние на качество продукта.

В зерне ферменты содержатся в тканях зародыша, алейронового слоя и эндосперма. Это характерные для живых растительных клеток ферменты, обуславливающие специфические функции в процессах обмена веществ.

Из множества ферментов, обнаруженных в зерне злаков, обстоятельному изучению подверглись лишь те, которые оказывают или могут оказать воздействие на качество продуктов переработки зерна. К ним относятся амилазы, протеазы, липазы, липоксигеназы, полифенолоксидазы и др. Наряду с этим было установлено, что некоторые ферменты зерна могут являться хорошими индикаторами его физиологического состояния.

Определение активности пероксидазы.

Пероксидаза активирует перекиси, в том числе и пе­рекись водорода. Под ее действием происходит окисле­ние различных фенолов и ароматических аминов. Этот фермент очень широко распространен в тканях расти­тельного и животного происхождения. Наибольшее коли­чество пероксидазы содержится в корнях хрена, редьки и ряда других корнеплодов.

 Принцип метода. Данный метод основан на способности пероксидазы катализировать окисление бензидина с образованием окрашенного соединения р-хиноидинамида.

Ход работы

1. Навеску в 1 г корня хрена, редьки или корнеплодов других растений растирают в ступке с кварцевым песком и затем водой количественно перено­сят в посуду на 10 мл и объем вытяжки доводят до мет­ки.

2. Вытяжку фильтруют через складчатый фильтр.

3. В колбу на 25 мл наливают 2 мл 1 %-ного раствора бен­зидина, 2 мл 3%-ного раствора перекиси водорода и 1 мл приготовленного ферментного препарата; содержимое колбочки перемешивают и оставляют стоять 3 минуты (по песочным часам).

4. Через 3 минуты в колбу прибавля­ют 10 мл 30%-ного раствора NaOH и перемешивают.

Выпавшее в осадок окрашенное соединение растворяют прибавлением 10 мл абсолютного спирта, а затем полу­ченный раствор колориметрируют по стандартному ра­створу.

Стандартный раствор готовят в мерной колбе на 25 мл. В колбу наливают 2 мл 1 %-ного раствора бензи­дина и 3 мл 0, 01 н. раствора КМnO₄.

Через 10 минут, когда появившаяся сначала зеленая окраска превратит­ся в темно-красную, прибавляют 10 мл 30%-ного рас­твора NaOH и 10 мл абсолютного спирта.

Вычисление результатов.За единицу пероксидазы принимают такую ее активность, при которой препарат пероксидазы за 3 минуты дает окрашивание, равное стандарту.

 Активность пероксидазы (С) в принятых единицах на 1 г растительной ткани будет равна:

С = h ₁ ^. 10

   h₂

где h₁ – толщина слоя образцового раствора; h₂ – толщина слоя испытуемого раствора.

Оборудование и реактивы: 1) колориметр, 2) колбы на 10 и 25 мл, 3) пипетки, 4) песочные часы на 3 мин., 5) фарфоровая ступка, 6) спирт абсолютный, 7) NaOH 30%-ный, 8) Н₂О₂ 3%-ная, 9) раствор бензидина в 1%-ной ледяной уксусной кислоте, 10)0, 01 н. КМnО₄

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: