Тема 18.  ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ГЕНОВ

В 1961 году два ученых из Франции Ф.Жакоб и Ж.Моно провели серию экспериментов с культурой кишечной палочки E.Coli. Надо отметить, что в клетках E.Coli синтезирует около 800 ферментов. Синтез одних идет постоянно, непрерывно – их называют констутивными. Другие же ферменты образуются в результате изменения среды обитания (например, после попадания в питательную среду определенных веществ). Эти ферменты так и называются – адаптивными или индуцибельными. Есть дополнительное вещество (индуктор) – фермент синтезируется, нет - синтез фермента не осуществляется.

E. Coli не может существовать без присутствия в питательной среде глюкозы, которая является источником углерода. Поэтому ферменты утилизации глюкозы относятся к разряду конститутивных. На питательной среде, содержащей глюкозу, клетки растут отлично, образуя колонию.

Жакоб и Моно изменили эксперимент, добавив в питательную среду не глюкозу, а дисахарид лактозу. Посеяли культуру E. Coli. Образовалась временная пауза. После короткой задержки рост клеток колонии возобновился и шел с той же скоростью, что и на глюкозе. Почему произошла задержка?

Чтобы использовать новое «меню», как оказалось, клетки E. Coli должны синтезировать сразу три фермента: В-лактозу, галактозидпермеаду и трансацетилазу. Под их действием лактоза распадается на галактозу и глюкозу. Следовательно, эти ферменты уже будут индуцибельными, а лактоза – индуктором, запускающим их синтез.

Вся информация о синтезе белков-ферментов заключена в генах. Почему, до поры до времени они молчат, кто их включил? Поначалу генетиков очень удивлял тот факт, что материала ядерной ДНК, учитывая ее огромный молекулярный вес, хватило бы примерно на 5 млн. белков. В действительности же в клетках млекопитающих синтезируется около 50 тысяч белковых молекул. Получается, что лишь 1% ДНК человека кодирует белки, а остальные 99% - непонятный баланс. Природа излишеств не любит, для чего же нужна остальная ДНК?

1. Одна из версий предполагала, что излишки ДНК просто увеличивают массу ядра, для нормального соотношения с цитоплазмой.

2. Вторая версия – излишки ДНК – это собрание бесполезных последовательностей нуклеотидов, которые накапливались веками. Возможно это «молчащие гены», детерминирующие признаки далеких предков (хвостатость, волосатость, многососковость, рост клыков и когтей).

Хорошо известно, что у отдельных новорожденных возникают атавизмы, следовательно, данные гены из разряда «молчащих» перешли в разряд работающих. Поэтому резонно предположить, что структурные гены находятся под контролем регуляторных генов. Именно они и определяют:

· на каком этапе онтогенеза включить в работу тот или иной структурный ген;

· как долго и с какой скоростью он должен транскрибироваться, сколько копий м-РНК надо сделать;

· при каких условиях структурный ген опять должен «замолчать».

Регуляторные гены должны согласовывать свою работу. Мы хорошо знаем, что в гидролизе или синтезе определенного вещества последовательно участвуют несколько ферментов. Поэтому Жакоб и Моно предложили, что структурные гены, детерминирующие ферменты утилизации лактозы, должны быть сцеплены и находиться в рядом расположенных локусах одной и той же хромосомы.

 

З     ген-регулятор            оператор      Z         Y         A          ДНК

5

Активность этих генов находится под контролем общего гена-регулятора, который, в нормальных условиях (в питательной среде присутствует глюкоза, а не лактоза) препятствует переходу этих трех структурных генов в активное состояние. Где же находится ген-регулятор? Сразу скажем, что отдельные моменты регуляции генной активности были открыты не сразу, а постепенно.

В ходе экспериментов выяснилось, что ген-регулятор может находится от контролируемых структурных генов на определенном расстоянии. Он содержит генетическую информацию для синтеза белка-репрессора. С него, как с матрицы, информация переписывается (транскрибируется) на м-РНК, последняя выходит в цитоплазму, встречается с рибосомой, начинается трансляция, т.е. синтез белка-репрессора. Пройдя ядерную мембрану, белок-репрессор не действует непосредственно на структурные гены, а оказывает влияние на участок (оператор), очень близко примыкающий к первому (Z) структурному гену.Оператор, к которому имеет сродство белок-репрессор, и тесно сцепленные с ним структурные гены, находящиеся под его контролем, образуют оперон.

Ген-регулятор не входит в состав оперона, хотя и может быть сцепленным с ним. Белок-репрессор соединяется с оператором и «запрещает» транскрипцию оперона. Белок-репрессор – особый белок, он называется аллостерическим, так как имеет два активных участка. Одним участком он может присоединиться и выключить весь оперон, делая данный участок генетически не активным (транскрипция подавляется). Другим активным участком он может связываться с индуктором (когда он появляется), делая это более охотно, оставляя оператор. В результате оперон переходит в активное состояние (со всех структурных генов будет транскрибироваться информация на м-РНК).

Развивая гипотезу Жакоба и Моно, ученые предположили, что рядом с оператором, находится дополнительный участок названный промотором. Он  служит своеобразным старт-сигналом. Этот участок выполняет две важные функции:

1. Именно здесь к молекуле ДНК присоединяется РНК-полимераза.

2. В силу того, что ДНК состоит из двух нитей, промотор должен определить какая из цепей присоединит к себе РНК-полимеразу, т.к. транскрипция происходит только одной цепи.

Таким образом, осуществляется индукция оперона. Без лактозы гены lac-оперона транскрибируются очень редко. Как только появляется индуктор (лактоза), индукция приводит к 1000-кратному повышению активности всех трех белков. Мы рассмотрим схему индуцибельной негативной регуляции. Негативной эта регуляция названа потому, что белок-репрессор, связываясь с оператором, запрещает транскрипцию, т.е. действует негативно на экспрессию генов оперона. Есть процесс совершенно противоположный, он называется негативной репрессией.

Так же кишечная палочка для своих нужд синтезирует аминокислоту триптофан. Делает это с помощью фермента триптофансинтетазы. Если мы принесем клетки колонии в питательную среду, где уже изначально очень большое содержание триптофана, то внутри клетки синтез фермента триптофансинтетазы подавляется. Из этого следует вывод: доступ к генетический информации контролируется как внутриклеточной средой, так и факторами внешней среды.

Представим ситуацию: под действием мутагенного фактора внешней среды произошла поломка в регуляторном гене. Если полностью убрать участок гена-регулятора, то исчезнет и белок-репрессор. Ведь ранее контролируемый оперон будет находиться в активном состояние и ферменты-белки будут синтезироваться постоянно, не зависимо от того, присутствует в среде глюкоза, лактоза или арабиноза. На синтез ненужного фермента затрачивается и энергия и материал. Постепенно клетка сама себя истощает. Другой аспект заключается в том, почему РНК-полимераза транскрибирует гены одного отдельно взятого оперона, а не все далее следующие? Дело в том, что оперон заканчивается определенным треплетом нуклеотидов –– стоп-сигналом (терминатор). Он останавливает продвижение РНК-полимеразы. Примечательно, что внутри оперона, каждый структурный ген отделен от соседних триплетом, названным внутренним терминатором. Чтобы РНК-полимераза «проскочила» этот участок, должен присутствовать белок-антитерминатор 1, белок-антитерминатор 2. За синтез этих белков также отвечают определенные регуляторные гены. Если они по какой-то причине не выполняют свою функцию, то транскрипция остановится после 1 или 2 гена.

Мутации на уровне любого гена (и структурного и одного из серии регуляторных) может привести к изменению фенотипа.

Структурные гены определяют последовательность аминокислот в структуре белковых молекул, участвующих в метаболических процессах (репликация, транскрипция, трансляция). Регуляторные гены – ответственные за все матричные процессы, контролируют структуру белков, функции которых отличаются от белков структурных генов (белок-активатор, белок-репрессор, белок-антитерминатор). В синтезе белка участвуют т-РНК, р-РНК, такие сложные ферменты как РНК-полимераза, состоящая из нескольких субъединиц.

Дифференциальная активность генов зависит от сигналов поступающих как из внутриклеточной, так и внешней среды. Пример. Тело мухи дрозофилы в норме серое, если в корм личинкам + нитрат серебра = муха получится желтой, но данный признак по наследству передаваться не будет. Меняя температуру на определенном этапе можно вместо щетинок получить лишнюю пару конечностей. У крокодила и черепахи из яиц, инкубируемых при температуре < 30⁰ – развиваются самки; при 32⁰ ♀ и ♂ ; при 33⁰ - только самцы.

Регуляция может происходить на уровне любого матричного процесса: и на уровне репликации (удвоение ДНК), и на уровне транскрипции, в процессе созревания и-РНК, и на уровне трансляции, и даже в процессе созревания продуктов трансляции.

1. Дифференциальная репликация. В силу того, что сперматозоид вносит в зиготу только ядерный материал, а первые стадии дробления вплоть до гаструляции обеспечиваются цитоплазмой и рибосомами яйцеклетки, в ооците (задолго до оплодотворения) идет усиленный синтез именно рибосом за счет многократной репликации р-ДНК.

В слюнных железах двукрылых насекомых образуются гигантские политенные хромосомы. Их образование указывает на то, что репликация в различных соматических клетках происходит неодинаково.

2). Дифференциальная транскрипция. На гигантских политенных хромосомах слюнных желез насекомых, которые представляют иногда до нескольких сотен идеальных ДНК были обнаружены пуфы – вздутия отдельных дисков, которые появляются в результате декомпактизации (распутывание) ДНК в момент активной транскрипции. Пуфирование весьма активно происходит на стадии развития личинки. Образование пуфов регулирует внутренняя среда, а именно стероидные гормоны (одним из них является гормон линьки – экдизон ). Как видим одним из условий, обеспечивающих дифференцированную активность генов, являются именно структуры хроматина, его декомпактизации наблюдаемая при появление пуфов.

3). Дифференциальная трансляция. Хорошо известно, что и-РНК может существовать:

- в нестабильной форме (сразу идет на контакт с рибосомами);

- сохранение и-РНК в цитоплазме в виде информосом – комплекса и-РНК с белками (открыты А.С.Спириным в 1966 году).

4). Дифференциальное созревание продуктов. Транскрипции и трансляции Сплайсинг про-и-РНК. Активность многих белков определяется их посттрансляционной модификаций (фосфорилирование, ацетилирование. Расщепление исходной полипептидной цепи на более мелкие фрагменты).

Общий вывод: У эукариот транскрибируемые отрезки ДНК разделены между собой отрезками «молчащей» нетранскрибируемой ДНК – эти участки названы разделителями или спейсерами. Считают, что именно в спейсерах располагаются участки ДНК, которым принадлежит решающая роль в регуляции транскрипции (т.е. работы структурных генов). К числу спейсеров относится промотор, связывающийся с РНК-полимеразой. Промотор, как правило, содержит характерный набор нуклеотидов и его условно называют ТАТА-блоком. Именно этот блок связывает белковые факторы; приводящие РНК-полимеразу II в активное состояние, т.е.готовность осуществлять транскрипцию.

У некоторых генов последовательность нуклеотидов другая, но она также точно указывает место начала транскрипции. Помимо ТАТА-блока в промоте есть и характерный СААТ-блок. При удаление этого участка скорость транскрипции резко снижается. У эукариот есть и другие регуляторные элементы, обладающие рядом необычных свойств (у бактерий таких аналогов нет). Сайленсеры – элементы, угнетающие, ослабляющие транскрипцию. Энхансеры – участки, расположенные на очень далеком расстоянии (за185 п.н.) – оказывают мощное позитивное действие, ускоряя транскрипцию в 100 раз.

Процесс транскрипции осуществляется РНК-полимеразой. Доказано, что данный фермент состоит из нескольких полипептидных цепей, названных субъединицами. Как видим РНК–полимераза – фермент сложный, состоящий из 4 основных субъединиц: двух одинаковых ά – цепей, β- и β₁ субъединиц.

2ά β β₁  - это так называемый минимальный фермент. Для узнавания стартового участка промотора (чтобы произошла связь с промотором и началась транскрипция), к min комплексу РНК-полимеразы должна присоединиться еще одна субъединица – сигма фактор (δ). Другими словами: δ–фактор инициирует транскрипцию. Изменяя эту субъединицу можно изменять сродство РНК-полимеразы к промоторам разных генов. Важное значение при этом отводится действию факторов внешней среды.

Например: Если любой организм (одноклеточную бактерию, мушку дрозофилу и т.д.), поместить в условия повышенной температуры – не смертельно, но явно угрожающей – организм начнет приспосабливаться. В срочном порядке, в больших количествах будут синтезироваться белки-спасатели. При этом уровень синтеза обычных белков сильно снижается. В данной ситуации активизируются гены «теплового» шока. На бактериях показано, что изменения происходят в связи с заменой сигма- актора, в результате чего РНК-полимераза приобретает сродство с промотором генов, детерминирующих эти белки. Механизмы работы РНК-полимеразы лучше всего изучены на кишечной палочке. Большой вклад внесла группа русских ученых под руководством Р.Б.Хесина.

Итак, сигма-фактор способствует нахождению нужного промотора, т.е. стартового участка. Синтез молекулы матричной РНК происходит в направлении от 5' к 3' и только на одной нити ДНК. Элонгация (т.е. наращивание молекулы м-РНК) идет под действием тетраметра (2ά β β₁) РНК-полимеразы (у кишечной палочки скорость ≈ 40-45 нуклеотидов секунду). Завершается процесс транскрипции только после того как к минимальному ферменту присоединиться (ро)-фактор – фактор терминации (остановки), после чего РНК-полимераза покидает данный структурный ген.

Интересно, что у E.Coli. одна и та же РНК-полимераза синтезирует т-РНК, р-РНК, и-РНК. У высших организмов (эукариот) 3 типа РНК-полимеразы: I - синтез р-РНК; II – синтез и-РНК; III – синтез т-РНК и низко малекулярных РНК – 5S РНК.

 

⇐ Предыдущая21222324252627282930Следующая ⇒

Поделиться: