Краткая характеристика витамина

Стр 1 из 3Следующая ⇒

СОДЕРЖАНИЕ

Вступление

1. Витамин В12 (циклокобаламин)

2. Общая информация об определении витаминов в биообъектах

. Определение витамина В12 различными методами

Заключение

Список использованной литературы

ВСТУПЛЕНИЕ

Витамины - это вещества, которые относятся к незаменимым факторам питания человека и животных. Это низкомолекулярные биологические активные вещества, обеспечивающие нормальное течение биохимических и физиологических процессов в организме. Они является необходимой составной пищи и оказывают действие на обмен веществ в очень малых количествах. Суточная потребность в витаминах измеряется в миллиграммах, микро граммах. Некоторые витамины могут вообще не синтезироваться в организме или синтезироваться в недостаточных количествах и должны поступать извне (суточная потребность холина - 1 г/сут, суточная потребность в полиненасыщенных высших жирных кислотах 1 г/сут).

Все витамины разнообразные по химическому строению, и свойствам. И их разделяют на 2 группы по растворимости:

· водорастворимые витамины - С, группа В, и др.

· жирорастворимые - А, Д, Е, К.

Витамины называют или латинскими буквами (А, В, С, D). Некоторые буквы, например В, охватывают целые группы: от B1 до B15. Ещё эти вещества называют химическим названием или по авитаминозу который присущ данному витамину.

1. Витамин В12 (Цианокобаламин)

Химическая формула

Соa-[a-(5, 6-Диметилбензимидазолил)]-Соb-кобамидцианид или(5, 6-диметилбензимидазолил)-кобамидцианид

Химическая структура

B12 имеет самую сложную по сравнению с другими витаминами структуру, основой которой является корриновое кольцо. Коррин во многом аналогичен порфирину (сложной структуре, входящей в состав гема, хлорофилла и цитохромов), но отличается от порфирина тем, что два пиррольных цикла в составе коррина соединены между собой непосредственно, а не метиленовым мостиком.

В центре корриновой структуры располагается ион кобальта. Четыре координационных связи кобальт образует с атомами азота. Ещё одна координационная связь соединяет кобальт с диметилбензимидазольным нуклеотидом. Последняя, шестая координационная связь кобальта остаётся свободной: именно по этой связи и присоединяется цианогруппа, гидроксильная группа, метильный или 5'-дезоксиаденозильный остаток с образованием четырёх вариантов витамина B12, соответственно. Ковалентная связь углерод-кобальт в структуре цианокобаламина - единственный в природе пример ковалентной связи металл-углерод.

Краткая характеристика витамина

Цианокобаламин - является одним из немногих водорастворимых витаминов, которые накапливаются в человеческом организме. Витамин B12 аккумулируется в таких органах как почки, печень и легкие, а так же селезенка. Оказывает существенное влияние на процессы обмена веществ - белков, синтез аминокислот, нуклииновых кислот, пуринов. Стимулирует рост у детей.

Витамин B12 представлен в виде насыщенно красного порошка, без вкуса и запаха. Витамин В12 не теряет своих свойств при воздействии высоких температур и попадании прямых солнечных лучей.

Витамину В12, точнее кобамидным коферментам, принадлежит важнейшая роль в синтезе, а возможно, и в переносе подвижных метильных групп. В процессах синтеза и переноса одноуглеродистых фрагментов наблюдается связь (механизм которой ещё не выяснен) между фолиевыми кислотами и группой кобаламина. Предполагают, что витамин В12 учавствует также в ферментной системе. Невозможность использования в организме В 12 возникает в результате атрофии железистых клеток дна желудка, продуцирующих гастромукопротеин, который является обязательным компанентом, обеспечивающим усвоение этого витамина организмом.

ИСТОЧНИКИ ВИТАМИНА В12

Витамин В12 является единственным витамином, синтез которого осуществляется исключительно микроорганизмами; ни растения, ни ткани животных этой особенностью не наделены. Этот витамин вырабатывается в пищеварительном тракте любого организма, мясо которых употребляется людьми в пищу, а также в пищеварительном тракте человека. В растительных продуктах содержится очень малое количество этого витамина. Они практически не способны синтезировать его (несмотря на то, что иногда содержат много кобальта, который входит в состав витамина B12).

Витамин B12 человек может в первую очередь получать с животной пищей, в том числе с мясом (особенно с печенью и почками), рыбой, яйцами и молочными продуктами. Главным местом накопления витамина В12 в организме человека является печень, в которой содержится до нескольких миллиграммов витамина. В печень он поступает с животной пищей или синтезируется микрофлорой кишечника при условии доставки с пищей кобальта. Так же источником витамина В12 могут быть обогащённые им продукты: например, таким источником являются сухие завтраки, пивные дрожжи и пищевые дрожжи, витаминизированные хлопья и изделия из дроблёного зерна, а также специальные добавки. Во многих странах пищевой промышленности витамин добавляют в такие продукты, как сухие завтраки, шоколадные батончики, энергетические напитки.

Так же витамин В12 производится посредством бактериальной ферментации. Для получения цианокобаламина используют следующие микроорганизмы Prop, freudenreichii ATCC 6207, Prop, shermanii ATCC 13673, Prop, shermanii BKM-103 и их варианты и мутанты.

Суточная потребность в витамине В12 для взрослого человека составляет около З мкг (0, 003 мг).

Физико-химические

Основаны на зависимости физических свойств вещества от его природы. Физико-химические методы анализа могут включать химические превращения определяемого соединения, растворение образца, концентрирование анализируемого компонента, маскирование мешающих веществ и т.д. В отличие от " классических" химических методов анализа, где аналитическим сигналом служит масса вещества или его объем, в физико-химических методах анализа в качестве аналитического сигнала используют интенсивность излучения, силу тока, электропроводность, разность потенциалов…

При взаимодействии витаминов с рядом химических соединений наблюдаются характерные цветные реакции, интенсивность окраски которых пропорциональна концентрации витаминов в исследуемом растворе. Поэтому витамины можно определить фотоколориметрически, например витамин В1 - при помощи диазореак-тива и т.д. Эти методы позволяют судить как о наличии витаминов, так и о количественном содержании их в исследуемом пищевом продукте или органах и тканях животных и человека. Для выяснения обеспеченности организма человека каким-либо витамином часто определяют соответствующий витамин или продукт его обмена в сыворотке крови, моче или биопсийном материале. Однако эти методы могут быть применены не во всех случаях. Встречаются трудности при подборе специфического реактива для взаимодействия с определенным витамином. Некоторые витамины обладают способностью поглощать оптическое излучение только определенной части спектра. В частности, витамин А имеет специфичную полосу поглощения при 328-330 нм. Измеряя коэффициент поглощения спектрофотометрически, можно достаточно точно определить количественное содержание витаминов в исследуемом объекте. Для определения витаминов В1, В2 и других применяют флюорометрические методы. Используют и титриметрические методы.

Биологические методы

Методы качественного обнаружения и количественного определения неорганических и органических соединений, основанные на применении живых организмов в качестве аналитических индикаторов. Живые организмы всегда обитают в среде строго определенного химического состава. В биологических методах анализа устанавливаются связи характера и (или) интенсивности ответного сигнала с кол-вом определяемого компонента. В качестве индикаторов применяются микроорганизмы (бактерии, дрожжи, плесневые грибы), водоросли и высшие растения, водные беспозвоночные и позвоночные животные (простейшие, ракообразные, моллюски, личинки комаров, олигохеты, пиявки, рыбы., насекомые, черви, а также ткани, различные органы и системы (нервная, кровеносная, половая и др.) теплокровных. Питательная среда может быть естественной, искусственной или синтетической.

Биологические методы основаны на определении того минимального количества витамина, которое при добавлении к искусственной диете, лишенной только данного изучаемого витамина, предохраняет животное от развития авитаминоза или излечивает его от уже развившейся болезни. Это количество витамина условно принимают за единицу (в литературе известны «голубиные», «крысиные» единицы). Большое место в количественном определении ряда витаминов: фолиевой, пара-аминобензойной кислот и др. - в биологических жидкостях, в частности в крови, занимают микробиологические методы, основанные на измерении скорости роста бактерий; последняя пропорциональна концентрации витамина в исследуемом объекте. Количество витаминов принято выражать, кроме того, в миллиграммах, микрограммах, международных единицах (ME, или IU).

Из пищевых продуктов витамины выделяют, используя полярные и неполярные растворители. Для разделения витаминов используются хромотаграфические методы - разделение и анализ смесей анализируемых веществ сорбционными методами в динамических условиях. Метод основан на различном распределении веществ между двумя несмешивающимися фазами - подвижной и неподвижной.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В12 ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ

Поскольку содержание кобаламинов в организме крайне незначительно, определение их возможно современными высокочувствительными методами - радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой. Применяют твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12. Поскольку витамин В12 является гаптеном, для проведения иммуноэнзимного анализа требуется получение конъюгатов этого соединения с бычьим сывороточным альбумином.

Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное. Ниже приводится описание метода по получению конъюгатой Альб- В12.

мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяют в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляют по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль). Реакционную смесь инкубируют в темноте в течение 2-х суток витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином юобавляют к 6, 5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0, 1 М карбонатном буфере, рН 9, 2. Реакцию конъюгирования проводят в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализируют в темноте при 4°С против 0, 01М трис-хлоридного буфера, рН 7, 2, содержащего 0, 15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции (соответственно цианкобаламина). Степень модификации БСА цианкобаламином определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при L=550 нм. В нашем случае она составила 0, 3 моля на моль белка.

Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получают из конъюгатов Альб-В12, определяя их концентрацию спектрофотометрически. В данной системе был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина. Количество связавшихся антител определяют, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.

Проводят работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.

Ниже приводятся условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.

Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1: 20 в фосфатном буфере с БСА в течение первых 3-х часов при 37 0С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты отмывают несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревают при 100 0С в растворе 0, 3N NaOH с KCN и с дитиотретолом /ДТТ/ для перевода всех дериватов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Используют следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл - для витамина В12 и 20нг/мл.

Стандартные растворы и испытуемые образцы - 0, 1 мл - помещают в специальные пробирки и добавляют по 0, 1 мл раствора NaOH(0, 3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывают крышечками из фольги и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждают и вносят по 0, 1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводят в течение 12-14 часов при 4-60, после чего планшеты снова отмывают, а затем вносят соответственно по 0, 1 мл антител против витамина В12 в разведении 1: 1000. Планшеты снова помещают в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывают ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0, 1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1: 10000 и помещают в термостат на 2 часа, снова отмывают ФСБ и затем добавляют 0, 1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляют 4% H2SO4. Результаты спектрофотометрируют на при L=450 nm. На основании стандартных разведений строят кривую, по которой затем определяют концентрацию исследуемого соединения(В12) в испытуемых образцах.

Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании данного метода.

Всего определение витамина было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700± 150 мг/мл (350-900).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ В РАСТВОРАХ

Спектрофотометрический

Растворы, содержащие в 1 мл 0, 03 мг, и растворы, со-0, 1; 0, 2; 0, 5 или 1 мг в -1 мл, предварительно водой в.отношении 1: 2, 1: 4, 1: 10 и 1: 20, помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя в 1 см и определяют оптическую плотность при длине волны 361 нм.

Содержание цианокобаламина в миллиграммах в 1 мл (х) вычисляют по формуле:

X =( E *10* v )/201

где v - разведение, 10- постоянный коэффициент, Е- найденная оптическая плотность.

Колориметрический метод

Испытуемый раствор наливают в кювету метра с толщиной слоя 1-2 см и находят величину оптической плотности раствора (зеленый светофильтр). По найденной величине, пользуясь калибровочным графиком, устанавливают содержание витамина В12 в 1 мл раствора прямым путем.

Для построения калибровочного графика берут растворы чистого кристаллического цианокобаламина, содержащие 0, 02; 0, 025; 0, 03; 0, 035; 0, 04; 0, 045; 0, 05; 0, 055; 0, 065 и 0, 07 мг в 1 мл и определяют оптическую плотность этих растворов.

На оси абсцисс откладывают содержание витамина B12, а на оси ординат-соответствующие плотности.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сегодня существует масса методов анализа биологических систем, таких как молекулярная динамика, жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, рентгеноструктурный анализ, инфракрасная спектроскопия, электронная микроскопия, сканирующая электронная микроскопия, биофизические нанотехнологии. Но в связи с тем, что каждый исследуемый продукт имеет ряд индивидуальных характеристик, которые невозможно определить тем или иным методом, применять в биохимической деятельности приходится далеко не все подобные методы. Так же роль играет и не очень хорошее обеспечение реагентами лабораторий, и высокая стоимость, а также продолжительность некоторых аналитических процессов.

Следовательно, современная научная деятельность нуждается в новых и более выгодных методах исследования веществ.

В курсовой работе я рассматривала физико-химические и биологические методы анализа. Все эти методы удобны и действенны, а кроме того ещё и надёжны. Я считаю, что работать только с теоретическим материалом мало для того, чтобы сделать точную оценку методам определения витамина В12, но возможности для практической работы нет.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Борисова Т.Г. Основы технологии антибиотиков и витамина В12

2. Девятнин В.А. Методы химического анализа в производстве витаминов

. Богомолов А.И. Современные методы исследования органических веществ

. Шнайдман Л.О.. Производство витаминов

. www.vitamini.ru