ОПРЕДЕЛЕНИЕ В12 РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ

 

Рассмотрим возможность применения этих методов для определения цианокобаламина в биологических обьектах.

Применение физико-химических методов

·   Хроматография

Цианкобаламин накапливается в клетках бактерий, поэтому операции по выделению витамина заключаются в следующем: сепарирование клеток, экстрагирование водой при рН 4, 5-5, 0 и температуре 85-90? С, в присутствии стабилизатора (0, 25% раствор натрия нитрита), Экстракция протекает в течение часа, после чего водный раствор охлаждают, нейтрализуют раствором едкого натра, добавляют коагулянты белка - хлорид железа трехвалентного и алюминия сульфат с последующим фильтрованием. Фильтрат упаривают и дополнительно очищают, используя методы ионного обмена и хроматографии, после чего проводят кристаллизацию витамина при 3-4С из водно-ацетонового раствора.

Итак, в данном случае в качестве аналитического метода используют тонкослойную хроматографию. Этот тип определения отличается простотой осуществления и экономией времени. Он основан на том, что растворимость биологически активных веществ весьма различна. Знание этой величины играет большую роль как при экстракции, так и при нанесении и разделении. Водорастворимые витамины на высушенном слое силикагеля значительно стабильнее жирорастворимых витаминов, что облегчает нанесение и количественное определение.

Условия разделения и результаты

При использовании смеси Генсхирта и Мальзахера на силикагеле цианкобаламин остается в точке старта (см. табл. 1), а водой перемещается (Rf * 100 е^22).

Обнаружение и возможности определения

 

Табл 1. Ориентировочная величина Rf x 100 и непосредственное обнаружение витамина В12 с использованием различных источников освещения на слоях силикагеля с флуоресцирующей добавкой

ВИТАМИН	Rf * 100		ОКРАСКА			ГРАНИЦЫ ОПРЕДЕЛ
	Уксусная к-та-ацетон-метанол	вода	в УФ-свете (254мм)	в УФ-свете (365мм)	Дневной свет
В12 (циклокобаламин)	0	22	тёмная	фиолетова	красная	1-0, 5-0, 3

Рис. 2. Одномерная хроматограмма водорастворимых витаминов.

 

Разделение водой на слое силикагель + флуоресцентный индикатор (время анализа около 40 мин); снято в коротковолновом УФ-свете. 1 - 30 мг тиамина • НС1; 2 - 3 мг рибофлавина; 7-10 дг цианокобаламина

Для идентификации относительно больших количеств цианкобаламина можно рассматривать подобную хроматограмму при различном освещении. При дневном свете по красной окраске можно определить еще 0, 3 мг, в Уф-свете при длине волны 365 мм - 0, 5 мг и при длине волны 254 мм - 1 мг в виде темных пятен на флуоресцирующем фоне. После хлорирования и опрыскивания раствором о-толидин - иодид калия (реактив № 32) можно еще обнаружить даже 0, 2 мг в виде фиолетовых пятен. Для микроопределения следует также использовать биоавтографию.

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВИТАМИНА В12 ИММУНОФЕРМЕНТНЫМ И СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ

Поскольку содержание кобаламинов в организме крайне незначительно, определение их возможно современными высокочувствительными методами - радиоиммунными, энзимоиммунными и иммунофлюоресцентными. Большинство наборов, выпускаемых фирмами в данное время, приспособлено для автоматизированных “закрытых” систем и очень дороги, поэтому разработка относительно недорогого иммуноферментного метода, приспособленного для “открытой” системы, является весьма актуальной проблемой. Применяют твердофазный иммуноферментный метод, используя моноклональные антитела против витамина В12. Поскольку витамин В12 является гаптеном, для проведения иммуноэнзимного анализа требуется получение конъюгатов этого соединения с бычьим сывороточным альбумином.

Получение конъюгатов проводили карбодиимидным методом. Для конъюгата витамина В12 использовали его карбоксильное производное. Ниже приводится описание метода по получению конъюгатой Альб- В12.

мг карбоксилатного производного цианкобаламина (7 мкмоль) растворяют в 2 мл абсолютного диметилформамида, и добавляют по 2 мг дициклогексилкарбодиимида(10 мкмоль). Реакционную смесь инкубируют в темноте в течение 2-х суток витамина В12 до выпадения кристаллов дициклогексилмочевины. Затем супернатант с N-гидрокси-сукцинимидилкобаламином юобавляют к 6, 5 мл раствора БСА(10 мг/мл) в 0, 1 М карбонатном буфере, рН 9, 2. Реакцию конъюгирования проводят в течение 6 часов при комнатной температуре в темноте, после чего конъюгат диализируют в темноте при 4°С против 0, 01М трис-хлоридного буфера, рН 7, 2, содержащего 0, 15М хлорида натрия для удаления несвязавшихся продуктов реакции (соответственно цианкобаламина). Степень модификации БСА цианкобаламином определяли спектрофотометрически, используя коэффициент экстинкции 8700 М -1 см -1 при L=550 нм. В нашем случае она составила 0, 3 моля на моль белка.

Твердофазным носителем служили иммунологические планшеты, которые были сенсибилизированы растворами конъюгатов. Стандартные растворы получают из конъюгатов Альб-В12, определяя их концентрацию спектрофотометрически. В данной системе был применен непрямой конкурентный метод иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител против витамина. Количество связавшихся антител определяют, используя конъюгат анти-IgG человека с пероксидазой хрена /анти-IgG-ПХ/, по его связыванию с твердой фазой. Субстратом реакции служил ТМВ.

Проводят работа по подбору эквивалентных концентраций всех реагентов, участвующих в реакции.

Ниже приводятся условия постановки реакции с указанием подобранных разведений для всех реагентов.

Сенсибилизацию планшетов проводили конъюгатами Альб-В12 и Альб-фолат в разведении 1: 20 в фосфатном буфере с БСА в течение первых 3-х часов при 37 0С, а затем в течение ночи в холодильнике. Затем планшеты отмывают несколько раз ФСБ. Антигены, т.е. стандартные растворы и испытуемые образцы, предварительно прогревают при 100 0С в растворе 0, 3N NaOH с KCN и с дитиотретолом /ДТТ/ для перевода всех дериватов в циан-форму и предотвращения денатурации при кипячении. Используют следующие концентрации стандартных растворов: 1300 пг/мл, 650 пг/мл, 300 пг/мл, 150 пг/мл и 75 пг/мл - для витамина В12 и 20нг/мл.

Стандартные растворы и испытуемые образцы - 0, 1 мл - помещают в специальные пробирки и добавляют по 0, 1 мл раствора NaOH(0, 3 N) c KCN(1мг/мл) и ДТТ (50мкл ДТТ на 6 мл раствора щелочи). Пробирки закрывают крышечками из фольги и помещают на 10 мин в кипящую водяную баню. Затем все пробы охлаждают и вносят по 0, 1 мл в сенсибилизированные планшеты. Реакцию проводят в течение 12-14 часов при 4-60, после чего планшеты снова отмывают, а затем вносят соответственно по 0, 1 мл антител против витамина В12 в разведении 1: 1000. Планшеты снова помещают в холодильник на 12-14 часов, после чего их в очередной раз отмывают ФСБ. Затем во все лунки планшета вносили по 0, 1 мл анти-IgG-ПХ в разведении 1: 10000 и помещают в термостат на 2 часа, снова отмывают ФСБ и затем добавляют 0, 1 мл ТМВ, а после развития окраски через 10-15 мин реакцию закрепляют 4% H2SO4. Результаты спектрофотометрируют на при L=450 nm. На основании стандартных разведений строят кривую, по которой затем определяют концентрацию исследуемого соединения(В12) в испытуемых образцах.

Ниже приведены стандартные кривые, полученные при использовании данного метода.

 

 

Всего определение витамина было проведено в образцах крови 25-ти доноров и 250-ти больных с различными видами анемий. Средние значения витамина В12 в норме составило 700± 150 мг/мл (350-900).

ОПРЕДЕЛЕНИЕ В РАСТВОРАХ

Спектрофотометрический

Растворы, содержащие в 1 мл 0, 03 мг, и растворы, со-0, 1; 0, 2; 0, 5 или 1 мг в -1 мл, предварительно водой в.отношении 1: 2, 1: 4, 1: 10 и 1: 20, помещают в кювету спектрофотометра с толщиной слоя в 1 см и определяют оптическую плотность при длине волны 361 нм.

Содержание цианокобаламина в миллиграммах в 1 мл (х) вычисляют по формуле:

X =( E *10* v )/201

где v - разведение, 10- постоянный коэффициент, Е- найденная оптическая плотность.

Колориметрический метод

Испытуемый раствор наливают в кювету метра с толщиной слоя 1-2 см и находят величину оптической плотности раствора (зеленый светофильтр). По найденной величине, пользуясь калибровочным графиком, устанавливают содержание витамина В12 в 1 мл раствора прямым путем.

Для построения калибровочного графика берут растворы чистого кристаллического цианокобаламина, содержащие 0, 02; 0, 025; 0, 03; 0, 035; 0, 04; 0, 045; 0, 05; 0, 055; 0, 065 и 0, 07 мг в 1 мл и определяют оптическую плотность этих растворов.

На оси абсцисс откладывают содержание витамина B12, а на оси ординат-соответствующие плотности.

⇐ Предыдущая123

Поделиться: