Карбогидразы - ферменты, разлагающие углеводы. Определяя карбогидразы, выявляют т.н. сахаролитические свойства микробов.

⇐ ПредыдущаяСтр 3 из 3

С этой целью используют следующие среды:
а) среды Гисса (жидкие и полужидкие с индикаторами). О ферментативной активности бактерий судят по изменению цвета среды и образованию газа;
б) дифференциально-диагностические среды с лактозой (Эндо, Левина. Плоскирева и др.);
в) полиуглеводные среды (типа Олькеницкого, Клиглера и др.).

2. Протеазы - ферменты, разлагающие белки:
а) Для выявления указанных ферментов исследуемую культуру засевают на ряд сред: свернутая сыворотка, столбик желатина (разжижение в положительных случаях), молочный агар в чашке Петри (в положительных случаях вокруг колоний появляются зоны помутнения);
б) расщепление аминокислоты триптофана за счет действия фермента триптафаназы сопровождается образованием индола. Последний выявляется с помощью бумажки, смоченной щавелевой кислотой и укрепленной под пробкой над питательной средой. В положительныхслучаях бумажка краснеет;
в) для выявления ферментов расщепления серосодержащих аминокислот (цистин, цистеин) ставят пробы на H₂S (бумажка, пропитанная ацетатом свинца, чернеет).

г) для выявление аммиака используют лакмусовую бумагу (посинение).
д) для выявления уреазы - фермента, расщепляющего мочевину, в питательную среду нейтральной рН добавляют мочевину и индикатор. В положительных случаях среда изменяет цвет за счет сдвига рН в щелочную сторону в связи с образованием аммиака.

3. Липазы - ферменты разложения липидов и липоидов. Чаще всего определяют лецитиназу посевом на желточный агар. Лецитиназа расщепляет лецитин, при росте колоний вокруг них появляются опалесцирующие зоны, отражающие лецитиназную активность.
4. Гемолизины - ферменты расщепления фосфолипидной мембраны эритроцитов. Они выявляются посевом культуры на кровяной агар (5-10%). Различают бэта-гемолиз или полный гемолиз, когда образуются зоны просветления вокруг колоний, альфа-гемолиз, неполный гемолиз, при наличии зон зеленого цвета вокруг колоний. Отсутствие гемолиза обозначается как гамма-гемолиз.
5. Оксидо-редуктазы:
1. Определение оксидаз. На фильтровальную бумагу, смоченную 1% раствором тетраметилпарафенилендиамина, петлей наносят полосы испытуемой культуры. В положительном случае появляется фиолетовое окрашивание полос (в течение 1 мин).
2. Определение каталазы. Каплю 3% раствора перекиси водорода наносят на предметное стекло и туда вносят петлю испытуемой культуры. В присутствии каталазы образуются пузырьки кислорода.
3. Определение дегидраз. О наличии дегидраз судят по редуцирующей способности микроба, т.е. способности восстанавливать некоторые органические красители (например, 1% водный раствор метиленовой синьки).

Рост и размножение бактерий. Фазы размножения бактерий в закрытых системах.

Ø Рост – координированное воспроизведение всех компонентов бактериальной клетки и увеличение ее биомассы.

Ø Размножение – воспроизводство и увеличение количества клеток, приводящее к образованию бактериальной популяции.

Стадии роста периодической бактериальной культуры:

Фаза (стадия)	Характеристика
Лаг-фаза	Деления клеток не происходит
Положительного ускорения	Скорость деления клеток увеличивается
Логарифмического роста (экспоненциальная)	Скорость деления клеток максимальная
Отрицательного ускорения	Скорость деления клеток снижается
Стационарная фаза максимума	Количество живых клеток постоянно
Ускоренной гибели	Количество живых клеток начинает снижаться (убывает с увеличивающейся скоростью)
Логарифмической гибели	Количество живых клеток убывает с максимальной скоростью
Уменьшения скорости гибели	Количество живых клеток убывает с уменьшающейся скоростью
Стационарная фаза минимума	Количество живых клеток минимально

Классификация микроорганизмов по типу дыхания. Культивирование анаэробных бактерий. Этапы выделения культур анаэробных бактерий.

В зависимости от того, какую роль кислород играет в процессах получения энергии, все микроорганизмы подразделяются на 6 групп:

1) облигатные аэробы - им необходимо большое количество кислорода;

2) микроарофилы - кислород необходим в небольших количествах, меньше, чем в атмосферном воздухе;

3) капнофилы - при культивировании необходимы O₂ и CO₂;

4) облигатные анаэробы - не могут расти в присутствии кислорода;

5) аэротолерантные анаэробы - могут расти в присутствии небольшого количества кислорода;

6) факультативные анаэробы - используют как аэробное, так и анаэробное дыхание, или ферментирование. Это зависит от доступности кислорода.

Культивирование и выделение чистых культур анаэробных бактерий.

Культивирование анаэробов производят в бескислородных условиях или создают сниженное парциальное содержание кислорода в среде или в воздухе. Отношение бактерий к кислороду можно определить, произведя посев культуры уколом в столбик агаризованной питательной среды. Аэробы вырастут на поверхности столбика, анаэробы - в глубоких слоях ПС. Факультативные анаэробы будут расти как на поверхности среды, так и в ее глубине.

Необходимые условия для культивирования анаэробных микроорганизмов создаются физическими, химическими и биологическими методами.

Физические методы.

Регенерация (кипячение) жидких питательных сред.

После посева их заливают сверху слоем парафинового или вазелинового масла для разобщения от атмосферного воздуха.

Посев в «высокий столбик».

Кислород воздуха диффундирует обычно на расстоянии 1, 5-2, 0 см от поверхности среды, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

Выращивание культур в анаэростатах.

Анаэростаты представляют собой металлические цилиндрические сосуды с герметически закрывающейся крышкой, в которой имеется ниппель для соединения его с насосом с помощью вакуумной резиновой трубки. Из анаэростата вакуумным насосом откачивается воздух. Степень разреженности воздуха контролирует манометр.

Аппарат Киппа. Более старый способ замены воздуха индифферентным газом, например водородом.

Химические методы.

1. Добавление в среду редуцирующих и легко окисляемых веществ.

Добавляют кусочки паренхиматозных органов ( печень, селезенка и др. ), глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин. Применяют и неорганические восстановители: сульфиды, сероводород, цитраты.

2.Химическое поглощение кислорода воздуха происходит при добавлении, например щелочного раствора пирогаллола в особых приборах, примером которого может служить свеча Омелянского - стеклянный прибор в форме свечи. Внутрь помещают одну пробирку с жидкой средой с посевом анаэробов (среда Китта-Тароции). На дно прибора наливают щелочной раствор пирогаллола. Сверху прибор закрывают стеклянным колпачком и парафинируют;

3. Для образования водорода и углекислого газа, необходимых для роста облигатных анаэробов используются специальные пакеты, при добавлении воды в которые происходит активация с выделением соединений, которые связывают кислород воздуха (газогенераторные пакеты).

Биологические методы.

1.Совместное выращивание анаэробов и аэробов - Метод Фортнера . В основе метода лежит комбинированный посев культур анаэробов и аэробов. Посев производят в чашку Петри с толстым слоем сахарного кровяного агара (агар Цейсслера), который разделяют посредине чашки прокаленным стерильным скальпелем, вырезая небольшую полоску агара по диаметру. На одну половину среды засевают культуру аэробных бактерий, на другую - анаэробных. Чашку парафинируют и помещают в термостат. При росте аэробы поглощают кислород и создают тем самым условия для роста анаэробных бактерий.

2. Использование в питательных средах биологических редуцирующих веществ (кусочков печени, почек, крови, и др.).

Среда Китта-Тароции. Состав: МПБ, кусочки печени, глюкоза. Готовую среду сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют. Посев материала производят пастеровской пипеткой под слой масла.

Среда Цейсслера. Состав: МПА, 1% глюкоза, 20% дефибринированной крови. Используется для получения изолированных колоний анаэробных микроорганизмов, а также для изучения гемолитической активности бактерий.

⇐ Предыдущая 1 23