Характеристика основных таксонов. Понятие о виде как основной номенклатурной единице. Штамм, клон, чистая культура. Инфраподвидовые категории – морфовар, хемовар, серовар, биовар, фаговар, патовар.

Стр 1 из 3Следующая ⇒

Таксономия — наука о принципах и методах распределения (классификации) организмов в иерархическом плане.

Выделяют высшие таксоны – Царство, Отдел, Класс, Порядок, Семейство, Триба, Род, Вид. Основной таксономической единицей в биологии является вид (species).

Вид – это эволюционно сложившаяся совокупность микроорганизмов, имеющих единое происхождение, сходный генотип и максимально близкие фенотипические признаки и свойства.

Принципы систематики:

q Филогенетический (для крупных таксонов).

q Фенотипический. В нем используются:

§ Тинкториальные свойства — способность окрашиваться различными красителями.

§ Культуральные свойства — особенности роста бактерий на жидких и плотных питательных средах.

§ Подвижность

§ Спорообразование — форма и характер расположения споры в клетке.

§ Физиологические свойства — тип питания; тип дыхания.

§ Биохимические свойства — способность ферментировать различные субстраты.

§ Антигенные свойства.

q Генотипический. В ее основе лежит изучение нуклеотидного состава ДНК и наиболее важных характеристик генома, в частности, его размера (величина, объем, молекулярная масса) и других параметров. Наиболее точным методом установления генетического (геномного) родства между бактериями является определение степени гомологии ДНК. Чем больше идентичных генов, тем выше степень гомологии ДНК и ближе генетическое родство.

q Смешанный. В основе лежит принцип сопоставления организмов по возможно большему количеству учитываемых признаков при допущении, что все они для систематики равноценны.

Изменчивость микроорганизмов приводит к тому, что некоторые признаки в пределах одного и того же вида могут варьировать. Отсюда сложилось понятие о вариантах (варах, типах), или инфраподвидовых категориях, микроорганизмов, которые отличаются отдельными признаками от стандартных видов. Так, различают: морфологические ( морфовары ), биологические ( биовары ), ферментативные ( ферментовары или хемовары ), различные по резистентности к антибиотикам и бактериофагам ( резистенсвары и фаговары ), различные по антигенной структуре ( серовары ) и патогенности для хозяев ( патовары ) варианты бактерий.

Идентификация - установление их таксономического положения микроорганизмов и, прежде всего их видовой принадлежности. Определение видовой принадлежности является решающим моментом бактериологической диагностики инфекционных заболеваний. Чаще всего для идентификации патогенных бактерий изучают их морфологические, тинкториальные, культуральные, биохимические и антигенные свойства.

Штаммом называют культуру, выделенную из определенного источника, или из одного и того же источника в разное время. Штаммы обозначают либо протокольными номерами, либо по источнику выделения (человек, животное, внешняя среда), либо по местности (городу), где он был выделен. Штамм — более узкое понятие, чем вид.

Клоном называют культуру микроорганизма, выделенную из одной клетки (одноклеточная культура).

Чистая культура представляет собой микробные особи одного и того же вида, выращенные из изолированной колонии, выращенной на твердой питательной среде.

Согласно бинарной (биноминальной) номенклатуре каждый микроорганизм имеет название, состоящее из двух слов: первое слово означает род и пишется с прописной буквы, второе слово означает вид и пишется со строчной буквы.

Например, Escherichia coli.

Классификация патогенных прокариот по Берджи.

" Определитель бактерий-9" вышел в свет в1993г.

Согласно определителю Берги царство Procaryotae разделено на отделы, отличающиеся друг от друга строением клеточной стенки и отношением к окраске по способу Грама.

В составе 4-х отделов главных категорий прокариот выделяют:

q Отдел I. Грамотрицательные эубактерии, имеющие клеточную стенку, или Gracilicutes.

q Отдел II. Грамположительные эубактерии, имеющие клеточную стенку, или Firmicutes.

q Отдел III. Эубактерии, лишенные клеточной стенки, или Tenericutes. Названии бактерий – микоплазмы.

q Отдел IV. (Архебактерии, или Mendosicutes).

Отделы определителя Берги, в свою очередь, подразделяются на группы.

§ грациликуты включают 1-16-ю группы,

§ фирмикуты - 17-29-ю,

§ тенерикуты представлены одной 30-й,

§ мендозикуты - 31-39-й группами.

В составе групп выделено более 200 родов прокариот, распределенных по семействам и подгруппам.

В «Определителе» детальному описанию видов предшествует обобщенная характеристика трех наиболее ярких признаков, используемых для их идентификации:

1) отношение к кислороду;

2) отношение к источникам энергии и питательных веществ;

3) особенности морфологии.

Принципы устройства иммерсионного, люминесцентного, электронного микроскопов. Типы микроскопических препаратов.

Тип микроскопии	Вид микроскопии	Используемый микроскоп	Эффект (принцип метода)	Применение в микробиологии
Электронная микроскопия	Электронный	Вместо светового пучка используется пучок электронов	· Изучение вирусов · Изучение ультраструктуры микробной клетки
Световая микроскопия	Обычная световая	Биологический микроскоп	См. курс физики	В микробиологии используется редко
Иммер- сионная	Биологический микроскоп + иммерсионный объектив	Иммерсионное масло, помещаемое между предметным стеклом и объективом, устраняет потери попадающих в объектив лучей света вследствие своего одинакового со стеклом коэффициента преломления	Наиболее часто используется в бактериологии для микроскопического метода исследования
Темно-польная	Биологический микроскоп + темнопольный конденсор	В объектив попадают лишь преломленные на объекте лучи (светлый объект на темном фоне)	Используется для микроскопии очень тонких объектов – например, спирохет
Фазово-контрастная	Биологический микроскоп + фазово-контрастная приставка	Превращает изменение фазы световой волны, которая меняется при прохождении прозрачных объектов, в воспринимаемое глазом изменение ее амплитуды	Используется для изучения прозрачных, неокрашенных, объектов – например, микоплазм
Люмине-сцентная (флюоре-сцентная)	Люминесцен-тный (флюоресцен-тный) микроскоп	Регистрирует фотолюминесценцию объекта (свечение под действием ультрафиолета)	· Микроскопия мазков, окрашенных флюоресцирующими красками (аурамин, родамин, корефосфин и др.) · Оценка реакции иммунофлюоресценции (РИФ)

В лабораторной практике используют следующие типы микроскопических препаратов:

1. Бактериологический мазок (фиксированный мазок). Готовят из патологического материала (гноя, мокроты, фекалий), а также из колоний и чистых культур микроорганизмов.

2. «Висячая» и «Раздавленная» капля. Используют для изучения подвижности микроорганизмов при участии темно-польной микроскопии.

3. Тонкий мазок крови.

4. «Толстая» капля крови.

5. Препарат-отпечаток. Готовят из внутренних органов, мяса, колбасных изделий.

6. Тушевой препарат.

7. Мазки-близнецы (готовят из гноя и мокроты вязкой консистенции).

Нитевидные формы бактерий.

Различают два типа нитевидных бактерий:

1. образующие временные нити.

2. образующие постоянные нити

Временные нити образуют палочковидные бактерии при нарушении условий их роста или регуляции клеточного деления. При восстановлении механизма регуляции деления и нормальных условий роста эти бактерии восстанавливают обычные для них размеры.

Этапы приготовления фиксированного мазка.
Взятие материала для исследования. Для приготовления препарата исследуемый материал берут из пробирки, колбы или чашки Петри бактериологической петлей или стерильной пипеткой.
Пробирку с бактериальной культурой берут в левую руку, а петлю за петледержатель — в правую. Петлю прожигают в пламени горелки до покраснения. Вращательным движением вынимают из пробирки ватную пробку, прижимая ее V и IV пальцами правой руки к ладони, и обжигают край пробирки. Осторожно вводят петлю в пробирку, охлаждая ее о внутреннюю поверхность, после чего легким скользящим движением берут материал. Затем вынимают петлю из пробирки, снова обжигают ее край и затыкают пробкой. После приготовления препарата петлю обязательно прожигают (стерилизуют) в пламени. Жидкий материал из пробирки или колбы можно набирать пипеткой, удерживая ее в правой руке и закрывая отверстие II пальцем.
Приготовление фиксированных препаратов-мазков. Для приготовления препарата на обезжиренное предметное стекло наносят каплю воды или изотонического раствора хлорида натрия, в которую петлей вносят исследуемый материал и распределяют его таким образом, чтобы получить тонкий и равномерный мазок диаметром около 1—1, 5 см, только при таком распределении материала в мазке можно увидеть изолированные бактериальные клетки. Если исследуемый материал содержится в жидкой среде, то петлей его непосредственно наносят на предметное стекло и готовят мазок. Мазки высушивают на воздухе или в струе теплого воздуха над пламенем горелки.
Для фиксации мазка предметное стекло (мазком вверх) медленно проводят 3 раза (в течение 3 с) через пламя горелки. Микроорганизмы при фиксации погибают, плотно прикрепляясь к поверхности стекла, и не смываются при дальнейшей обработке. Более длительное нагревание может вызвать деформацию клеточных структур. Мазки крови, мазки-отпечатки органов и тканей и в некоторых случаях мазки из культур фиксируют погружением на 5-20 мин в метиловый синий или этиловый спирт, смесь Никифорова, сулемовый спирт или другие фиксирующие жидкости.

Окраска по Граму (механизм)

Этап	Продолжительность	Результат
Грамположительные	Грамотрицательные
Генциановый фиолетовый	1 – 2 минуты	Синие	Синие
Раствор Люголя	1 – 2 минуты	Синие	Синие
Этиловый спирт с последующим промыванием водой	½ минуты	Синие	Бесцветные
Водный фуксин	1 – 2 минуты	Синие	Красные

Методы выявления спирохет.

- Спирохеты плохо воспринимают красители. Обычно их окрашивают по методу Романовского-Гимзе или серебрением по Морозову, а также применяют негативное окрашивание по методу Бурри; в живом виде их исследуют с помощью фазово-котрастной и темнопольной микроскопии.

Метод Романовского-Гимзе. Краситель состоит из эозина, метиленового синего и азура растворенных в смеси метанола с глицерином. Базофильная зернистость окрашивается в синий цвет, эозинофильная - в красный, а нейтрофильная - в сиреневый цвет.

Техника окраски.

1. Приготовить микроскопический препарат и обработать его в жидком фиксаторе.

2. Поместить фиксированный препарат на два стеклянных валика в чашку Петри вниз ко дну и подливают разведенный в 10-20 раз свежеприготовленный краситель. Окрашивание длится от 30-60 минут до нескольких часов.

3. Мазки промывают водой и высушивают на воздухе.

Таксономия и классификация.

Царство. Fungi (Mycota)

Отдел. Eumycota (настоящие грибы)

Классы. 1. Chytridiomycetes

2. Hyphochytridiomycetes (один патогенный возбудитель взывает микозы)

3. Oomycetes (один патогенный возбудитель взывает микозы)

4. Zygomycetes (род Мycor, вызывают мукороз)

5. Ascomycetes (сумчатые грибы, дрожжи)

6. Basidiomycetes (вызывают криптококкоз, разноцветный лишай; шляпочные грибы, большинство съедобных грибов)

7. Deuteromycetes (многие паразиты животных, растений и человека; роды Candida, Aspergillius, Penicillius)

Грибы состоят из длинных тонких нитей-гифов, которые образуют мицелий. Низшие грибы имеют гифы без перегородок (представители классов1-4). Гифы высших грибов разделены на перегородки, которые образуют многоклеточный мицелий (представители классов 5-7). Совершенные грибы размножаются половым и бесполым путем (классы 4, 5, 6). Несовершенные грибы имеют только бесполый путь размножения (классы 1, 2, 3, 7). Бесполое размножение осуществляется почкованием или фрагментацией. Грибы, существующие, преимущественно с помощью почкующихся клеток, называются дрожжевыми (класс 5) и дрожжеподобными (класс 7). Также, бесполое размножение осуществляется с помощью эндогенных спор (у низших грибов), которые созревают в головке-спорангии, и экзогенных спор - конидий.

Микроскопические исследования грибов.

1.Окраска простыми методами: водным фуксином или метиленовым-синим.

2. Окраска мазков по Граму.

3. Приготовление препарата " раздавленная капля" из участка мицелия с плодоносящими гифами для изучения при световой микроскопии на малом и большом увеличении.

4. Для обнаружения гранул гликогена в клетке дрожжей. При приготовлении препарата " раздавленная капля" под покровное стекло вводят раствор Люголя. Гликоген окрашивается в красно-бурый цвет.

5. При микроскопии патогенных грибов, исследуемый материал помещают на предметное стекло в каплю 10-20% щелочи или спирта с глицерином и накрывают покровным стеклом. Исследуют через 20 минут.

Риккетсии

Риккетсии – это прокариоты, наделенные чертами сходства с вирусами.

С вирусами их роднит:

1) абсолютный внутриклеточный паразитизм;

2) невозможность культивирования на искусственных питательных средах.

Таксономия риккетсий

Царство: Procaryota

Отдел: Gracilicutes

Порядок: Rickettsiales

Семейство: Rickettsiaceae

Триба: Rickettsiaе

Род: Rickettsia; Orientia; Bartonella; Сoxiella

Таксономия хламидий

Царство: Procaryota

Отдел: Gracilicutes

Порядок: Chlamydiales

Семейство: Chlamydiaceae

Род: Chlamydia, Chlamydophila

Методы обнаружения хламидий

n Окраска по Романовскому-Гимзе. Используется для определения хламидий на начальных и конечных этапах цикла. Они выглядят пурпурными на фоне голубой цитоплазмы клетки.

n Обработка мечеными флюорохромами сыворотками – метод РИФ.

n Обнаружение внутриклеточных включений в виде приядерных шапочек цитологическими методами: Туревича, Муромцева и др.

n Окраска по Граму - грамотрицательны (на практике не используется).

Методы выявления.

1. Бактериологический метод: это наименьшие микроорганизмы, которые могут расти на сложных по составу искусственных питательных средах, необходимым компонентом которых является холестерол. Вырастают микроскопические колонии с характерным углублением в центре (яичница-глазунья).

2. Молекулярно-биологический метод: (ПЦР).

3. Экспресс-диагностика: для выявления антигена в исследуемом материале используют РИФ, ИФА.

Классификация ферментов

1) Экзо- 1) Обмена 1) Конститутивные

2) Эндо- 2) Агрессии 2) Индуцибельные

(индуктивные)

По катализируемым реакциям:

Гидролазы

Оксидоредуктазы

Изомеразы

Трансферазы

Лиазы

Лигазы (синтетазы)

По разлагаемым субстратам:

Протеолитические (протеазы)

Липолитические (липазы)

Ферменты агрессии

Инвазивности

§ гиалуронидаза

§ фибринолизин

§ нейраминидаза

§ коллагеназа и др.

Агрессивности

§ лецитиназа (лицитовителлаза)

§ коагулаза

§ уреаза

§ ДНК-аза и др.

Физические методы.

Посев в «высокий столбик».

Кислород воздуха диффундирует обычно на расстоянии 1, 5-2, 0 см от поверхности среды, а в глубине создаются благоприятные условия для роста облигатных анаэробов.

Химические методы.

1. Добавление в среду редуцирующих и легко окисляемых веществ.

Добавляют кусочки паренхиматозных органов ( печень, селезенка и др. ), глюкозу, аскорбиновую кислоту, цистеин. Применяют и неорганические восстановители: сульфиды, сероводород, цитраты.

2.Химическое поглощение кислорода воздуха происходит при добавлении, например щелочного раствора пирогаллола в особых приборах, примером которого может служить свеча Омелянского - стеклянный прибор в форме свечи. Внутрь помещают одну пробирку с жидкой средой с посевом анаэробов (среда Китта-Тароции). На дно прибора наливают щелочной раствор пирогаллола. Сверху прибор закрывают стеклянным колпачком и парафинируют;

3. Для образования водорода и углекислого газа, необходимых для роста облигатных анаэробов используются специальные пакеты, при добавлении воды в которые происходит активация с выделением соединений, которые связывают кислород воздуха (газогенераторные пакеты).

Биологические методы.

1.Совместное выращивание анаэробов и аэробов - Метод Фортнера . В основе метода лежит комбинированный посев культур анаэробов и аэробов. Посев производят в чашку Петри с толстым слоем сахарного кровяного агара (агар Цейсслера), который разделяют посредине чашки прокаленным стерильным скальпелем, вырезая небольшую полоску агара по диаметру. На одну половину среды засевают культуру аэробных бактерий, на другую - анаэробных. Чашку парафинируют и помещают в термостат. При росте аэробы поглощают кислород и создают тем самым условия для роста анаэробных бактерий.

2. Использование в питательных средах биологических редуцирующих веществ (кусочков печени, почек, крови, и др.).

Среда Китта-Тароции. Состав: МПБ, кусочки печени, глюкоза. Готовую среду сверху заливают слоем вазелинового масла и стерилизуют. Посев материала производят пастеровской пипеткой под слой масла.

Среда Цейсслера. Состав: МПА, 1% глюкоза, 20% дефибринированной крови. Используется для получения изолированных колоний анаэробных микроорганизмов, а также для изучения гемолитической активности бактерий.