Изучение механизма фиксации молекулярного азота

Дальнейшие исследования по фиксации N2 бактериями были посвящены изучению механизма фиксации. В этом особо большое участие принимал Отто Мейергоф (1884-1951). Работами Мейергофа и Дина Барка началась новая эра в исследовании фиксации N₂. Микрореспирометрия позволила осуществить точное определение количества фиксируемого азота и эффективность фиксации на единицу органического вещества простыми средствами. Эти данные привели к развитию теоретических основ и критической оценке физиологических опытов. Мейергоф и Барк измерили зависимость фиксации N2 азотобактером от парциального давления кислорода и установили, что наибольший выход микробной биомассы достигается при концентрации кислорода около 4 %. Для построения кривой фиксации N2 Барк применил уравнение Михаелиса для энзиматических реакций. В своих опытах он впервые использовал молекулярный жидкий водород. По результатам этих опытов он установил, что константа Михаелиса по азоту составляет 0, 21 атм. С целью получения кинетических данных и для расчета константы Михаелиса для азота он преобразовал степенную функцию в прямое уравнение и установил основные параметры роста. В дальнейшем этот метод, предложенный Лайневивером и Барком (1934), способствовал развитию исследований по кинетике энзимов.

В тот же период, когда Мейергоф и Барк проводили свои исследования по Azotobacter chroococcum, в министерстве сельского хозяйства США в Мэдисоне работали по симбиотической фиксации N₂. Поскольку первоначально опыты по фиксации N₂ ризобиями в чистой культуре не дали однозначных результатов (1931), то такие исследования были проведены с большим размахом в вегетационных опытах с клевером. Клевер был посажен в девятилитровые сосуды, наполненные прокаленным песком и питательным раствором, не содержащим азота. Чтобы измерить константу Михаелиса, парциальное давление кислорода поддерживалось постоянным на уровне 0, 20 атм, а парциальное давление N₂ варьировалось. В качестве восстановителя использовался молекулярный водород. Когда однажды водород случайно забыли ввести, растения стали расти значительно лучше. Проведенные затем опыты с аргоном и гелием показали, что водород специфически подавляет фиксацию N₂ (Wilson, 1936, 1938). Группа Барка подтвердила эти данные, и в 1940 году они сообщили, что Н2 специфически тормозит связывание N2 также и у Azotobacter vinelandii. На основании задержки фиксации N2 свободным водородом был сделан вывод о том, что бактерии, фиксирующие азот, должны иметь гидрогеназу. Водород (Н2) задерживает фиксацию N2 у азотобактера, клостридий и бобовых растений. Позднее у A. vinelandii, A. agile и у клубеньковых растений была выявлена гидрогеназа. Нитрат как легкодоступный источник азота снижает активность гидрогеназы. Это положение привело к следующему заключению: если все фиксаторы азота содержат гидрогеназу, тогда среди бактерий, имеющих гидрогеназу, должно быть много фиксаторов азота. Этот вывод способствовал расширению поиска большого числа гидрогеназоактивных бактерий, и в 1949-1953 годах было обнаружено большое число видов бактерий фиксаторов азота.

После открытия Гельригеля и Вильфарта способность фиксировать N₂ была обнаружена у фототрофной бактерии Rhodospirillum rubrum. За короткое время фиксация азота была выявлена и у других фототрофных бактерий. Бейеринк уже в 1901 году сделал заключение о способности цианобактерий (Anabaena, Nostoc) фиксировать N2. Цианобактерий были найдены в полностью свободной от азота воде горячих источников Йеллоустоунского национального парка еще в 1928 году. После того как в эту воду была внесена почва, в ней развились только синезеленые водоросли. Из этого было сделано заключение о том, что цианобактерии могут связывать азот.

 

Многообразие азотфиксирующих бактерий

 

Другая большая группа организмов, способных фиксировать азот, была обнаружена значительно позднее. Из такого же места обитания, что и цианобактерии, были выделены пурпурные бактерии. Если бы тогда было сделано такое же заключение, как и для цианобактерии, то пурпурные бактерии как фиксаторы азота были бы открыты ранее. Обнаружить способность пурпурных бактерий к фиксации N2 не удалось Ван Нилю (1931), а также Рольфсону (1931). В 1941 году Буррис использовал постоянный источник азота ¹⁵N и с его помощью установил фиксацию азота у Klebsiella pneumoniae, Desulfovibrio, Methanobacterium omelianskii, Bacillus polymyxa и B.macerans. Красный пигмент в клубеньках бобовых растений с 1939 и 1945 годов стал известен как гемоглобин.

Потребность в молибдене для фиксации N2 была открыта Г. Бортельсом (1930) в опытах с Azotobacter chroococcum. При манометрических исследованиях по дыханию и росту Барк (1934) обнаружил, что молибден может быть частично заменен ванадием. В 1937 году Бортельс установил необходимость молибдена для люцерны, соевых бобов, красного клевера. Данные были подтверждены Андерсоном в Австралии, который вносил молибден в богатую железом красноземную почву (terra rossa) и установил значительное улучшение роста клевера. Эффект от этих микроэлементов наиболее отчетливо наблюдался поблизости от ржавой колючей проволоки.

Открытие свободноживущих азотфиксирующих бактерий в окультуренных почвах (под сельскохозяйственными угодьями) привело к тому, что в ряде институтов были учреждены лаборатории микробиологии Бейеринка. В университетах стали преподавать бактериологию и проводить исследования. В примечании настоящей книги описано становление института сельскохозяйственной бактериологии в Геттингене.

 

 

Контрольные вопросы.

 

41. История открытия азотфиксирующих бактерий.

42. Работы по изучению механизма циксации молекулярного азота.

43. Многообразие азотфиксирующих бактерий.

 

 

Тема лекции №10

Биохимические процессы и их единство

План

1. Открытие процессов брожения вне клетки.

2. Изучение коферментов.

3. Фитохимическая редукция дрожжей.

4. Теория О. Варбурга. Изучение гемина.

5. Изучение обмена веществ в клетках бактерий.

6. Концепция «Биохимическое единство».

7. Гетеро- и автотрофная фиксация СО₂.

8. Ростовые факторы.

9. Антибиотики и антиметаболиты.

10. Хемиосмотическая теория.

 

 

Открытие процессов брожения вне клетки

 

Процесс брожения вне клетки был открыт случайно. Братья Эдвард (1860-1917) и Ганс (1850-1902) Бюхнеры в Тюбингене и Мюнхене впервые обнаружили, что дрожжевой сок, полученный растиранием дрожжей с песком (с последующим отжатием и фильтрованием для отделения целых и разрушенных клеток), сохраняет способность сбраживать глюкозу до спирта. Этот дрожжевой сок они готовили для инъекции животным (1896). Коричневый отжатый дрожжевой сок они пытались стабилизировать и консервировать добавкой сахара (40 %-ной глюкозой). Через 20 минут началось пенящееся брожение. Таким образом, был осуществлен первый сложный биохимический процесс вне клеток. Это сенсационное открытие было опубликовано Э. Бюхнером в 1897 году и привело к исследованию внутриклеточного обмена веществ с помощью внеклеточной системы. После того как Бюхнер (1903) установил влияние фосфата на интенсивность образования СО₂, А. Гарден и В. Ю. Янг (1906) подробно изучили этот процесс и нашли, что добавление фосфата сильно ускоряет образование спирта и СО₂, а фосфат присоединяется к углеводу с образованием фруктозе-1, 6-бифосфата. Вскоре было выяснено образование и других фосфорных эфиров.

 

Изучение коферментов

 

В 1905 году Э. Бюхнер и В. Антони и почти одновременно Гарден и Янг (1906) открыли действие коферментов. Они обнаружили, что диали-зированный дрожжевой сок не вызывает брожения сахара, однако после объединения диализированного дрожжевого сока и диализата брожение возобновляется. Компоненты, входящие по отдельности в эти растворы, были названы «апоферменты» и «коферменты».

Значительной вехой в развитии сравнительной биохимии стали работы О. Мейергофа. Он обнаружил в 1918 году, что кофермент, необходимый для спиртового брожения, осуществляемого бесклеточным дрожжевым соком, и образование молочной кислоты в мышечной ткани животных взаимозаменяемы. Обнаружение сходства процессов спиртового брожения у дрожжей и молочнокислого брожения в мышцах животных значительно ускорило изучение внутриклеточного обмена веществ.

 

⇐ Предыдущая123456789Следующая ⇒

Поделиться: