Антибиотики и антиметаболиты

 

Исследования антибиотиков стимулировали развитие молекулярной биологии. Наблюдения антибиотического эффекта возвращают нас ко времени Роберта Коха. Открытие пенициллина Александром Флемингом (1881-1955) в 1928 году и систематические исследования Говарда Флори (1898-1968) и Эрнеста Чейна (1906-1979) подготовили победоносное движение антибиотиков. Были очищены и изучены тысячи антибактериальных соединений. Но только малая часть этих антибиотиков могла быть использована как терапевтическое средство. Исследование механизмов действия дало плодотворные импульсы для молекулярной биологии, особенно изучения механизма репликации ДНК, транскрипции и трансляции РНК и функционирования мембран.

Стратегия борьбы с инфекционными заболеваниям и раневыми инфекциями с помощью микробных метаболитов исходит из исследований промежуточного обмена у бактерий. С 1910 по 1914 год Л. Михаелис наблюдал конкурентные отношения между ингибиторами и продуктами реакции ферментативного разложения углеводов. В 1927 году Ю. Г. Квестел и В. Р. Вулдридж показали, что активность сукцинатдегидрогеназы конкурентно подавляется малонатом. Решающие открытия последовали вслед за тем, как Герхард Домак (1885-1964) экспериментально исследовал пневмококковую инфекцию на животных и получил положительный эффект пронотозила in vitro и in vivo (1935) от сульфаниламидных компонентов молекулы. То, что сульфаниламид действует как структурный аналог или антиметаболит 4-аминобензойной кислоты, впервые было обнаружено Д. Д. Вудсом в Оксфорде в 1940 году. С тех пор концепция подавления или контроля биохимических процессов структурными аналогами метаболитов стала основополагающей в исследованиях по биологии клетки и для создания хемотерапии, бактериостатических веществ, многочисленных биологически активных веществ, гербицидов.

 

Хемиосмотическая теория

 

Пониманию того, как макроорганизмы могут быть поражены бактериями, служит хемиосмотическая гипотеза. Питер Митчелл (1920-1992) разработал эту концепцию в Кембридже и развил ее, полностью обновив, в Эдинбурге, куда он переселился в 1955 году. Объектами, на которых он проверял свою гипотезу, были суспензии бактерий, такие как Streptococcus pyogenes, Micrococcus luteus, Paracoccus denitrificans и Escherichia соli, а также митохондрии живых крыс. С 1953 года уже было известно о субстратной специфичности бактерий, а также обсуждались вопросы о мембранных и барьерных белках и пермиазах и возможности применения законов кинетики ферментов и термодинамики к обмену веществ. Было установлено, что процессы поглощения и выделения энергетически зависимы, но о процессах превращения энергии при дыхании ничего не было ясно. Первые работы Митчелла по транспорту фосфатов были посвящены изучению транспорта фосфатов через клеточную стенку Streptococcus pyogenes (1953). Работы на бактериях привели и 1957 году к созданию общей теории транспорта через мембраны, процесса, обозначаемого до 1958 года как групповая транслокация.

Понятие «хемиосмотический» впервые было использовано Митчеллом в 1957 году и впервые предано гласности в 1960 году. Понятия симпорт и антипорт, движущая протон сила и протоновый потенциал пыли настолько революционны, что не принимались почти 20 лет. Идеи Митчелла представляли собой действительный прорыв в биологии. Они дали первые убедительные доказательства того, что бактериальная клетка не является «мешком с ферментами», куда их складывают биохимики, но представляет собой высокоорганизованное структурированное образование. Эта концепция оказалась очень плодотворной для понимания окислительного фосфорилирования при дыхании и светопоглощающем транспорте электронов при фотосинтезе.

 

 

Контрольные вопросы.

 

44. Открытие процессов брожения вне клетки.

45. Открытие коферментов и их изучение.

46. Фитохимическая редукция дрожжей.

47. Теория О. Варбурга. Изучение гемина.

48. Сущность концепции «Биохимическое единство».

49. Гетеро- и автотрофная фиксация СО₂.

50. Ростовые факторы. Антибиотики и антиметаболиты.

51. Хемиосмотическая теория.

 

 

Тема лекции №11

Структура и функции клетки

План

1. Изучение структуры клетки.

2. Подвижность бактерий.

3. Таксисы.

 

Изучение структуры клетки

 

Включения в бактериальной клетке. У бактерий, которых изучали под микроскопом еще в XVIII веке, были обнаружены тельца, хорошо преломляющие свет, значение которых было неизвестно. Эти включения описал Эренберг в 1838 году как Monas okenii. Так как он отнес эти гигантские бактерии к «маленьким животным», родственникам простейших (Protozoa), он соответственно и описал эти структуры следующим образом:

С такой фантазией позднее уже никто не описывал внутренние структуры бактерий. Природа веществ в клетке бактерий, различимых под микроскопом в виде гранул и капель, интересовала ботаников с 1880 года. Они установили с помощью микрохимических реакций, что в клетках водорослей, грибов, листьев, семян и плодов содержатся нейтральные жиры, полисахариды, запасные белки.

Полисахариды. С помощью йодистого калия П. Ван Тигем уже в 1877 году установил наличие у Bacillus amylobacter голубых телец крахмала, и Бейеринк в 1893 году у Granulobacter polymyxa - коричнево окрашенных гранул гликогена. У многих бактерий, описанных в последующие 60 лет, был обнаружен либо крахмал, либо гликоген; в большинстве случаев гранулы были очень малы и неразличимы. Escherichia coli была, по-видимому, забыта. Обнаружение у Е. coli большого количества гликогеноподобных полисахаридов (полиглюкозы) явилось неожиданностью.

Поли-β -гидроксимаслянаякислота. При использовании липидофильного красителя судан III удалось установить у бацилл и Azotobacter chroococcum «жировые тельца». Артур Мейер уже в 1899 и 1912 годах заметил, что в вегетативных клетках некоторых видов бактерий при обработке eau de gavelle (щелочной водой) происходит почти полное растворение включений, за исключением жироподобных гранул. Карл Стапп (1888-1984), обнаружив в 1924 году растворимость жиров Azotobacter в хлороформе, не смог, однако, выяснить их химическую природу. Идентификацией жировых телец как поли – β - гидроксимасляной кислоты мы обязаны случайной находке Лемуаня (1926, 1927). Суспензия Bacillus megaterium была оставлена им в дистиллированной воде в отсутстние доступа воздуха, в результате чего последовало выделение кислоты. Кислота была идентифицирована как β -гидроксимасляная и как исходный продукт поли- β -гидроксимасляной кислоты. Так продолжалось до 1943 года, пока не было установлено сходство между полимерами, открытыми у В. megaterium, и жиром, накапливающимся у Azotobacter chroococcum, но это сообщение вышло на французском языке и долгое время оставалось неизвестным широкому кругу ученых. И только благодаря одной публикации Макре и Вилкинсона (1958)¹⁶⁴ ПГБ (полигидроксибутиловая кислота) стала известна в странах, где не были знакомы с франкоязычной литературой. С тех пор ПГБ в большом количестве была обнаружена у многих бактерий как резервное вещество.

Гранулы полифосфата. Химическая природа полифосфатных гранул, широко распространенных у водорослей, грибов и бактерий, стала известна с 40-х годов XIX столетия. А. Мейер, который обнаружил эти гранулы у Spirillum volutans, назвал их волютиновыми гранулами. Он описал эти гранулы по негативным признакам: не окрашиваются йодом и суданрот, не растворимы в органических растворителях, растворимы в воде и щелочи и в eau de gavelle. Он предположил, что это резервные вещества белкового характера или нуклеиновые кислоты. «Если волютин действительно имеет отношение к нуклеиновым кислотам, что, вероятно, следует из моих микрохимических исследований, то он содержит наряду с Н, О и С [...] еще и N и Р» (Меуег, 1912). Но попыток определить состав волютина не было им предпринято.

Полифосфатные гранулы были первыми включениями, описанными у бактерий. Бейбс (1889) и Гилермон (1903) сообщили о существовании до тех пор еще не известных включений у микро- и коринебактерий и рассматривали их как метахроматиновые гранулы. Метахроматиновая реакция основывается на сдвиге абсорбционного максимума основных красителей в коротковолновой области, в случае толуидинблау - между 630 и 530 нм, вследствие образования комплекса молекул полифосфатов. Несмотря на появление многочисленных работ о гранулах волютина, никаких успехов относительно их химической природы достигнуто не было. Только в 1947 году И. М. Вейм выделил это вещество из дрожжей и идентифицировал его как неорганический полифосфат. А полимер неорганического фосфата выделил Либерман из дрожжей уже в 1888 году. Заслуга Вейма состоит однако в том, что он объединил цитологические и химические данные и установил, что давно известные метахроматические тельца, волютиновые гранулы и отложения полифосфатов в клетке представляют собой одно и то же.

Эндоспоры. После того как было установлено исследованиями Ф. Кона (1872, 1877) на Bacillus subtilis и R. Коха (1876) на Bacillus anthracis существование термоустойчивых эндоспор, за короткое время было описано много спорообразующих бактерий. А. Пражмовски (1880) изучал образование спор на культурах В. subtilis и Clostridium butyricum. Сильное преломление света, которое Кон приписал высокому содержанию жира, основывается на содержании плотных веществ. Исследователя интересовали форма и величина спор, их положение в материнской клетке, процесс спорообразования, их освобождение, деление спор, теплоустойчивость, устойчивость к химическим веществам, облучению и тому подобное. Во многих работах имелись рисунки. В распоряжении исследователей уже находились микро­скопы с апохроматической оптикой и масляной иммерсией и целый ряд реагентов для осветления, протравливания и окраски. К числу тех, кто использовал необычные свойства микроскопа, принадлежал Артур Мейер и Марбурге. Он уже в 1897 году описал Bacillus (Astasia) asterosporus, которая потом оказалась идентичной В.polymyxa, и представил рисунок споры: в виде бочонка в длину и со звездообразным поперечником. Позднее ван ден Гооф и Анинга (1956) в работе, сделанной на основе электронной микроскопии, смогли подтвердить наблюдавшиеся Мейером структуры и с удивлением констатировали: «Мейер Пыл необычайно проницательным наблюдателем». Кроме него, ни один микроскопист, наблюдавший позднее споры В. asterosporus, не был в состоянии обнаружить эти детали. В остальном же удивительно, как мало к 1950-м годам было известно о спорах.

Параспоры. У некоторых аэробных спорообразующих бактерий можно выявить специфические включения ромбовидной формы. Первым описал у Bacillus такие тельца в 1911 году Э. Берлинер, назвавший их «покоящимися тельцами». Саму бактерию он выделил из больной личинки мучной моли (Ephestia kiihniella). Пробы были взяты в 1909 году изтюрингской муки, что было установлено по взятым пробам исследовательской лаборатории по обработке зерна в Берлине, куда были посланы эти образцы. Берлинер назвал болезнь «сонливостью» (Schlaffsucht), а у возбудителя болезни Bacillus thuringienis (1911, 1915) он описал образование ромбовидных телец, которые сопровождают процесс спорообразования, и предположил, что они возникают из содержимого клетки, которое не используется для образования спор. Однако ни он, ни О. Маттес (1927) в Марбурге не установили связи между болезнью и параспоральными включениями. Но уже в 1902 году Ишивата в Японии выделил из больных шелковичных червей (Bombyx mon) бактерию, которую назвал Bacillus sotto. Аоки и Шигасаки (1915) обнаружили, что ее клетки во время спорообразования образуют токсическое вещество. Болезнь шелковичных червей уже описал Пастер в 1870 году как «flacherie». А возбудитель впервые был выделен и описан К.Тумановым и К.Ваго в 1951 году и назван Bacillus cereus var. alesti. Кристаллические включения первыми наблюдали Э. А. Стейнхауз (1954) в Англии и Т.Ангус в Канаде. На возможность использования бактерий типа В. thuringiensis для биологической борьбы с вредными насекомыми впервые указал Стейнхауз (1951). Однако выделение новых штаммов и исследование их патогенности быстро пошло вперед и довольно скоро стало использоваться в практике.

Рибосомы. Открытие рибосом последовало после того, как в распоряжение микробиологических лабораторий поступила новая техника, такая как мощные центрифуги, ультрацентрифуги, радиоактивная маркировка. Деятельность Д. Д. Уотсона в Гарвардском университете и Р. Б. Робертса в Вашингтоне, начиная с 1957 года, привела от первых систематических исследований о рибонуклеопротеиновых частицах, определения их размеров и разделения по размерам к раскрытию их участия в синтезе белка.

Газовые вакуоли. Структуры, называемые в настоящее время газовым вакуолями, которые в большом количестве находятся в аноксигенных и оксигенных фототрофных бактериях, были впервые описаны Виноградским в 1888 году у Lamprocystis roseopersicina. Структуры, «которые выглядят как образование, наполненное воздухом в воде», Виноградский назвал «полостью». Он напомнил слова Ф. Кона, который видел клетки, «производящие впечатление пустых». Разные авторы давали этим I образованиям различные названия: газовые вакуоли (Klebahn, 1895), аэросомы - висящие тельца (Molish, 1903), псевдовакуоли (Lauterborn, 1915). Первые сведения о том, что вакуоли содержат газ, представили Г. Клебан (1895) и его сотрудник С. Стродтман (1895). Оба провели опыты с Gloiotrichia, и Стродтманн был первым, кто смог подвергнуть давлению эти вакуоли. В классическом опыте «Hammer, Kork und Flasche» (молоток, пробка и сосуд) было показано, что газовые вакуоли исчезают, если клетки подвергаются сильному давлению. Из этого и последующих экспериментов Клебан сделал вывод, что вакуоли содержат газ, вероятно азот, и окружены мембраной. Первые электронно-микроскопические снимки газовых вакуолей были сделаны на Halobaderium halobium. А то, что они состоят из скоплений и штабелей газовых пузырьков, было обнаружено в 1960-е годы (Bowen, Walsby).

Бактериальное ядро. Вопрос о том, имеют ли бактерии клеточное ядро, был поставлен, когда существование бактерий было твердо установлено, а с 1900 года эта проблема стала разрабатываться. Осложняли задачу недостаточные знания о составе ядерного вещества, хроматина. Существование двух нуклеиновых кислот стало известно с 1938 года. Для цитохимического доказательства существования хроматина надо было различать ДНК и РНК. Определение локализации гранул, содержащих ДНК, в бактериях началось после того, как Р. Фёльген и Войт (1924) установили, что ядра животных и растений можно окрасить основным фуксином в темно-фиолетовый цвет, если перед окраской нагревать препарат 1 N НС1 в течение четырех минут при 60°. Эта ядерная «реакция Фёльгена» основывается на освобождении сахарного альдегида из ДНК. Войт (1925-1927 годы) получил положительные результаты на бактериальных штрихах. К. Печман и А. Риппель (1932), а также Г. Пекарски и Б. Штиль (1937) осуществляли нуклеиновую реакцию на бактериях и дрожжах. К. Ф. Робиноу (1942, 1953) проследил морфологические изменения в ядрах во время клеточного деления, применил окраску Гимза и другие методы окраски и прояснил некоторые детали. Используя ферментативный гидролиз ДНК и РНК, а также белков с помощью ДНКазы, РНКазы и пепсина, Д. Петере и Р. Виганд (1953) доказали, что гранулы, которые благодаря окраске становятся видимыми, являются ДНК. Электронно-микроскопические исследования тонкой структуры на ультратонких срезах бактерий требовали больших усилий (Maaloe, Birch-Andersen, 1956), которые остались в тени из-за достижений в генетических исследованиях (Lederberg, 1947). Только возможность видеть хромосомы с помощью авторадиографии после введения ³Н-тимидина и обнаружения двойной спирали ДНК (Cairns, 1963) дало ответ на вопросы, поставленные цитологами.

Бактериальная стенка. То, что бактериальные клетки имеют клеточную стенку, было известно с времен Кона (1875). Исследования Е. Клиенбергер-Нобель (1935), описавшей α -формы Streptobacillus moniliformis и других бактерий, выделение Вейбулом (1953) с помощью лизоцима протопластов без клеточной стенки и исследования сферопластов, полученных с помощью пенициллина, подтвердили наличие клеточной стенки у бактерий. Хорошо организованные исследования бактериальной клеточной стенки были начаты разработкой методов выделения основных структур M. Р. Салтоном и Р.В. Горном (1951). Салтон (1952) обнаружил также разрушение изолированной клеточной стенки лизоцимом. Обнаружение того, что штаммы Staphylococcus aureus под действием пенициллина выделяют хорошо адсорбирующие ультрафиолетовый свет вещества, «парк-нуклеотиды», и выяснение структуры УДП-ацетилмурамовой кислоты стали началом успешных, ведущихся в хорошем темпе непрерывных исследований для выяснения химического строения гетерополимерных макромолекул клеточной стенки бактерий. Изучение структуры и разработка концепции о том, что основу клеточной стенки представляет «мешковидная макромолекула» (murein sacculus) - это заслуга тюбингского вирусолога Вольфхарда Вейделя (1916-1965). В остальном идентификация компонентов этого пептидо-глюканового остова является работой не одного исследователя, а совместных усилий вирусологов, физиологов бактерий, биохимиков и химиков.

Липополисахариды. С помощью серодиагностических исследований, которые с начала XX столетия в больших масштабах проводились на животных, растениях и микроорганизмах, были также исследованы липополисахариды (ЛПС) - О-антигены, ответственные за эндотоксические свойства энтеробактерий. По серологической реакции в роде Salmonella различаются сотни штаммов, и Б.Уайт (1931) и Ф.Кауфман (1937) разработали основные положения Кауфмана - Уайта схемы. Эта классификация серологических свойств является работой всей жизни Фрица Кауфмана; он выполнил важную задачу в медицинской диагностике и эпидемиологии. Уже в 1945 Карл Ландштайнер указал, что специфичность реакции антител должна основываться на различии полисахаридов. С целью изучить 0-специфичные гетерополисахариды химическими аналитическими методами, О. Вестфаль и О.Людериц (1952) начали анализировать большое число ЛПС новыми методами и описали большое число новых Сахаров и их связи, и подтвердили серологически обнаруженную разницу. С тех пор с помощью ЛПС можно охарактеризовать почти все грамотрицательные бактерии.

 

Подвижность бактерий

 

Подвижность бактерий наблюдал уже Левенгук, и в своих знаменитых зарисовках бактерий 1683 года он обозначил пунктиром их путь. Описание движения и жгутиков дал Эренберг (1838). В описании Monas okenii он сообщил свои наблюдения, сделанные в 1836 году: «Движение осуществляется посредством очень тонких, в половину длины тела, хоботков, которые двигаются подобно кнутам и одновременно возбуждают в мутной воде водоворот [...]. Движение качающееся и вращательное вокруг длинной оси». У Spirillum valutans жгутики были обнаружены впервые Коном в 1872 году. Окрашены же жгутики были впервые Кохом (1877). Методы окраски затем были значительно усовершенствованы Лёфлером (1889), а число и местоположение жгутика бактерий на клетке позволило установить размеры бацилл, клостридий и Pseudomonas. Дальнейшим описанием пучков жгутиков, их колебаний при переднем и заднем движении, вращения жгутика и клетки мы обязаны И. Будеру (1915). О скорости движения и скорости вращения жгутиков впервые смог высказаться Пауль Метцнер (1920), который применил стробоскопический метод наблюдений. Этот метод в примитивной форме был применен уже Мартиусом в 1884 году для исследования ресничек при мерцательных движениях; он основывается на применении быстро следующих друг за другом вспышек света. Если вспышки света следуют друг за другом сразу за каждым вращением жгутика, то движение кажется прекратившимся. Метцнер создал для своих опытов удивительно простой аппарат и измерил скорость вращения клетки. При комнатной температуре клетки Spirillum volutans вращались со скоростью 12-14 оборотов/с, а жгутики - 40 оборотов/с.

Так как размеры жгутика лежат далеко за разрешающей способностью световых микроскопов, а также в темном поле, то объяснение его строения стало возможным только с использованием электронного микроскопа. Г. Пекарский и Э. Руска представили в 1939 году первые снимки, и со времени, когда В. ван Итерсон в 1947 году опубликовала превосходные картины среза жгутиков, электронная микроскопия стала обычным методом микроморфологии. Снимки ван Итерсон (1953) позволили установить, что жгутик является органеллой, которая проникает I через мембрану цитоплазмы и клеточную стенку и берет свое начало в цитоплазме от базального тельца. В 1950-е годы жгутики находились в центре исследований. Среди ученых, занимающихся этой проблемой, | следует назвать Клеса Вейбула, А. Пюпера, Е. Лейвзона и А. А. Хоувинка.

Таксисы. При освещении исследований по чувствительности и раздражимости нельзя не упомянуть таксисы у бактерий. Реакции на раздр- жение у бактерий и других одноклеточных подвижных микроорганизмов были обнаружены Теодором Энгельманом (1843-1909) и Берлине и Вильгельмом Пфеффером (1845-1920) в Тюбингене и Лейпциге. Энгельман описал в 1881 и 1882 годах аэротаксис и, как «реакцию испуга» (отталкивания), фотофоботаксис. Хемотаксис в дальнейшем изучал Пфеффер (1883, 1888) на сперматозоидах папоротников и мхов, на бактериях и флагеллятах. Методы были очень просты. Стеклянные капилляры наполнялись раствором веществ - раздражителей, привлекающих и отталкивающих. Капилляр с одной стороны был закрыт, а с другой - направлен к пространству между покровным и предметным стеклами суспензии микроорганизмов (Пфеффер, 1883). Микроорганизмы собирались у отверстия капилляра - вокруг или в середине отверстия. Варьируя многие параметры и микроскопические приемы, Пфеффер обнаружил различное отношение бактерий к химическим веществам, их концентрации и конкуренции.

Пфеффер обсуждал также поведение и ответную реакцию у растений и бактерий, восприятие, эффект набухания, сигнальный механизм в современном понимании. Он установил, что основные молекулярные механизмы раздражения одинаковы у бактерий, миксомицетов, зеленых водорослей, высших растений и животных (1904). Только через десятилетия эти методы и теоретические положения снова были взяты на вооружение. Они положили начало исследований хемотаксиса на Escherichia coli Ю. Адлером. В своей экспериментально обоснованной теории о клеточной мембране, транспорте через нее субстрата, сенсорных процессах, регуляции энзимов и энергетическом обмене веществ Пфеффер опередил свое время и во многом стимулировал развитие клеточной биологии. Благодаря его многочисленным студентам, докторантам и иностранным гостям, а также учебнику (1897, 1904), идеи Пфеффера распространились по всему миру.

Работы Энгельмана по фотофоботаксису (1888) у пурпурных бактерий были продолжены и углублены Будером (1919) на Rhodospirillum rubrum. С помощью микроспектра, проецируемого в слой бактерии на препарате, можно было видеть, как бактерии собираются в 3 полосы в освещенной области, которая является адсорбционным максимумом, идентичным каротиноидам. Полосы в инфракрасной области приводят к плотному скоплению бактерий. С помощью оригинальных опытов Будер охарактеризовал фототаксические свойства Thiospirillum jenense (1915). Ученик Будера Шрамек изучал действенность законов Вебера (1934). Эти исследования были дальше продолжены А. Мантеном (1948) и Р. К. Клей­тоном (1953-1958), распространившими их на изучение взаимодействия между фото- и хемотаксисом.

 

 

Контрольные вопросы.

 

52. Изучение эндоспор и параспор.

53. История изучения клеточной стенки и бактериального ядра.

54. Подвижность и жгутики бактерий.

55. Таксисы.

56. Исследования полисахаридов, липополисахаридов, поли – β – гидроксимасляная кислота.

57. Изучение гранул полифосфата.

58. История открытия рибосом, газовых вакуолей, включения в бактериальной клетке.

 

 

Тема лекции №12

Экология микроорганизмов

План

1. Заслуги Ф. Кона.

2. Предпосылки возникновения «Экологии микроорганизмов» как науки.

3. Этапы становления «Экологии микроорганизмов» как науки.

 

Заслуги Ф. Кона

 

В первых исследованиях микроорганизмов почвы и воды принимали участие прежде всего ботаники и физиологи растений. В описании грибов большая заслуга принадлежит ботаникам В. Гофмейстеру, А. де Бари, О. Брефельду, братьям Л. Р. и К. Тюлян и другим.

Ф. Кон был первым, кто обратил внимание на значение бактерий в почвенных процессах, но разрешению вопросов, касающихся разложения целлюлозы, нитрификации, освобождения молекулярного азота (денитрификации), фиксации азота, образования перегноя и гумуса во многом способствовали физиологи растений и агрохимики. Условия, при которых наилучшим образом идет нитрификация, были хорошо известны во времена наполеоновских войн, благодаря подробным инструкциям по разбивке и уходу за «садами победы». To, что нитрификация является биологическим процессом, удалось показать, осуществляя перколяцию раствора через почвенную колонку и используя при этом обработку либо паром, либо хлороформом (Schloesing und Miintz, 1877; Warington, 1878).

 

⇐ Предыдущая123456789

Поделиться: