Определение активности липаз в семенах масличных

И злаковых культур

Липазы относятся к классу ферментов «Гидролазы» (подкласс эстераз) и очень широко распространены в растениях и клетках микроорганизмов. С их участием происходит гидролитический распад ацилглицеринов жира, в связи с чем эти ферменты объединены общим названием – триацилглицерол-липаза (3.1.1.3). В результате действия липаз образуются глицерин и свободные жирные кислоты:

 

СН₂ОСОR₁ CН₂ОН R₁–СООН

| липаза |

СНОСОR₂ + 3Н₂О ¾ ¾ ® СНОН + R₂− СООН

| |

СН₂ОСОR₃ CН₂ОН R₃− СООН

 

R₁, R₂ и R₃ – остатки жирных кислот

 

В ходе реакции гидролиза фермент последовательно катализирует расщепление первой сложноэфирной связи триацилглицерина, затем второй и далее третьей.

Большинство липаз находится в клетках растений или микроорганиз-мов в растворимом состоянии и имеют оптимум каталитического действия при рН = 8. Для проявления каталитической активности липаз необходимо присутствие в физиологической среде катионов Са²⁺.

От активности липаз зависит интенсивность мобилизации жиров в листьях и семенах растений для включения образующихся продуктов в обмен веществ, а также способность растительных продуктов к прогорканию, особенно при повышении температуры и влажности во время хранения муки, крупы, растительных масел. У каждого вида растений имеется свой набор липаз, отличающихся растворимостью, оптимумом рН и ионного состава среды. Липазы в значительном количестве содержатся в семенах зерновых и масличных культур, особенно их много в семенах клещевины.

Принцип метода. Определение активности липаз основано на титровании раствором щёлочи свободных жирных кислот, образующихся при взаимодействии с растительным маслом выделенных из растительных источников ферментов. Ферментную реакцию можно также проводить при смешивании с растительным маслом измельчённых семян зерновых и масличных культур.

Оборудование. Фарфоровые ступки с пестиками с диаметром 8-10 см; водяная баня; бюретка на 10 мл с трубкой, заполненной натронной известью; конические колбы с пробками на 150 мл; дозирующие пипетки на 1-10 мл; лабораторные весы; мерные колбы на 500 и 1000 мл; капельница для индикаторного раствора; марля для фильтрования, уложенная в 4 слоя; фарфоровые чашки диаметром 6-8 см.

Реактивы. Дигидрофосфат калия; гидрофосфат натрия; дистиллиро-ванная вода (свободная от диоксида углерода); гидроксид калия; 1% спиртовой раствор фенолфталеина.

Приготовление растворов. 1/15 М фосфатный буфер (рН=7, 4): 11, 866 г Na₂ HPO₄ ∙ 2Н₂ О растворяют в 1 л дистиллированной воды; 4, 537 г KH₂ PO₄ растворяют в 500 мл дистиллированной воды; затем 182 мл раствора дигидрофосфата калия смешивают с 818 мл раствора гидрофосфата натрия.

0, 05 М раствор КОН: 2, 806 г КОН помещают в фарфоровый стакан и растворяют в 300 мл дистиллированной воды, затем полученный раствор количественно переносят в мерную колбу на 1 л, объём раствора в колбе доводят водой до метки, содержимое колбы тщательно перемешивают и определяют точный титр полученного раствора.

1% раствор фенолфталеина: 1 г фенолфталеина растворяют в 100 мл 50% этилового спирта.

Ход определения. В фарфоровую ступку помещают 2 г сухих или 3 г прорастающих семян и растирают пестиком с небольшим количеством квар-цевого песка до получения однородной массы. Затем в ступку приливают 20 мл фосфатного буферного раствора (рН=7, 4) и смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. После этого суспендированную смесь переносят на марлю, уложенную в 4 слоя в фарфоровой чашку, и отжимают ферментный экстракт в чашку. Дозирующей пипеткой отбирают 2 пробы ферментного экстракта по 5 мл и помещают их в конические колбы, одну из которых ставят на 10 минут в кипящую водяную баню для инактивации ферментов. После охлаждения нагретой колбы в обе колбы (с активными и инактивированными ферментами) приливают пипеткой объём растительного масла, имеющий массу 3 ± 0, 01 г, полученную смесь перемешивают и колбу ставят на 30 минут в термостат при температуре 30°С, при этом фиксируют точное время начала ферментативной реакции. По истечении 30 минут смеси в колбах титруют с 3 каплями раствора фенолфталеина водным 0, 05 М раствором КОН.

Обработка и оценка результатов. Активность липаз вычисляют по формуле:

(V₂ - V₁ ) ∙ K ∙ 2, 8

А = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾,

Н ∙ t

 

где А – активность липаз в мг гидроксида калия, затраченного на титрование образующихся за 1 час при гидролизе жира кислот, в расчёте на 1 г растительной массы;

V₁ – объём 0, 05 М раствора гидроксида калия, затраченный на титрование образующихся под действием липаз жирных кислот, мл;

V₂ – объём 0, 05 М раствора гидроксида калия, затраченный на титрова-ние аналитической пробы с инактивированными ферментами, мл;

К – поправка к титру 0, 05 М раствора гидроксида калия;

Н – навеска растительного материала, г;

2, 8 – коэффициент пересчёта мл 0, 05 М раствора КОН в мг;

t – время ферментативной реакции в часах.

Полученный показатель активности липаз в конкретной растительной пробе сравнивают с другими данными, характеризующими уровень актив-ности липаз в семенах различных зерновых и масличных культур, а также изменение активности липаз в процессе прорастания семян. На основе полученного результата оценивают качество семян масличных культур и возможность их длительного хранения.

 

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют липазы?

2. Каковы особенности ферментных белков липаз?

3. Как влияют липазы на качество растительной продукции?

4. Под воздействием каких факторов повышается активность липаз?

5. Какой принцип положен в основу определения активности липаз?

6. Как получают ферментный экстракт липаз?

7. В чём состоят особенности проведения ферментной реакции и титрова-ния образующихся под действием липаз жирных кислот раствором КОН?

8. Каковы принципы расчёта активности липаз?

9. Как изменяется активность липаз при прорастании семян зерновых и масличных культур?

 

Определение активности нитратредуктазы

В растительной продукции

В большинстве почв, особенно окультуренных, довольно активно про-исходит процесс нитрификации, в ходе которого аммонийная форма азота, образующаяся в почве при распаде органических остатков, а также внесённая в виде удобрений, превращается в нитраты. Поступивший нитратный азот в растениях, прежде чем включиться в состав азотистых веществ, подвергается восстановлению в аммонийную форму с помощью специаль-ных ферментных систем. На первом этапе под действием фермента нитрат-редуктазы происходит превращение нитратов в нитриты, а затем нитриты с участием фермента нитритредуктазы восстанавливаются с образованием аммонийной формы азота, которая используется для синтеза аминокислот, амидов и других азотистых веществ.

Нитратредуктазы высших растений, зелёных водорослей и грибов (1.6.6.1; 1.6.6.2; 1.6.6.3) представляют собой металлофлавопротеиды с моле-кулярными массами 200-330 тыс., включающие два типа субъединиц: имеющие флавиновые группировки (ФАД, ФМН) и содержащие молибдено-вый кофермент. Донором электронов для восстановления нитратного азота у растений служит НАД× Н, у грибов – НАДФ× Н. От восстановленных динук-леотидов электроны и протоны переходят на флавиновую группировку нитратредуктазы. Затем электроны передаются на цитохром в₅₅₇, служащий в составе фермента промежуточным переносчиком электронов от флавинового на молибденовый кофермент, а протоны высвобождаются и могут взаимо-действовать с анионами кислорода, которые образуются при восстановлении нитратного азота.

Молибденовый кофермент содержит катионы молибдена, лабильно связанного с ароматической группировкой, которая присоединяется к белко-вой части фермента. Катионы молибдена, обратимо изменяя степень окисле-ния, способны акцептировать электроны от цитохрома в₅₅₇ и передавать их на азот нитрата, который связывается с активным центром фермента. В резуль-тате восстановления азота нитрат превращается в нитрит, а высвобожда-ющийся анион кислорода О^2- соединяется с протонами, образуя молекулу воды. Механизм восстановления нитратов до нитритов под действием нитратредуктазы может быть представлен в виде следующей схемы:

У растений наиболее высокая нитратредуктазная активность обнаруживается в меристематических тканях. У большинства растений при активном фотосинтезе и достаточном количестве углеводов, являющихся источниками образования НАД× Н, процесс восстановления нитратов практически полностью происходит в корнях. Однако при недостатке света и низких температурах, ослабляющих синтез углеводов, а также избыточном азотном питании значительная часть нитратов поступает в вегетативную часть растений и подвергается восстановлению в листьях. Вместе с тем известны растения, у которых практически не обнаруживается нитратредук-тазной активности в корнях. У них превращение нитратного азота в аммонийный осуществляется в основном в листьях. К таким растениям относятся свёкла, хлопчатник, марь, дурнишник и др.

Нитратредуктаза – типичный индуцибельный фермент. Его активность резко возрастает при поступлении в растения нитратов вследствие того, что происходит индукция синтеза фермента. Когда же концентрация нитратов в клетках растений уменьшается, синтез ферментного белка прекращается и нитратредуктазная активность снова понижается до исходного уровня. Кроме нитратов, индукторами синтеза нитратредуктазы могут быть цитокинин и органические нитросоединения, то есть возможна индукция синтеза этого фермента под воздействием химических регуляторов. В то же время катионы аммония подавляют в растениях синтез нитратредуктазы.

Известны группы растений, имеющие природно невысокий уровень нитратредуктазной активности, вследствие чего они накапливают высокие концентрации нитратов. К таким видам относятся растения семейства тыквенные, шпинат, редька и др. Однако у большинства растений повышение содержания нитратов наблюдается при определённых неблаго-приятных условиях выращивания, связанных с недостатком световой энергии, низкой температурой, недостатком фосфора, калия, ряда микроэлементов, избыточными дозами азотных удобрений. Поэтому для каждой группы растительных продуктов установлена предельно допустимая концентрация нитратов.

При недостатке света ослабляются процессы фотосинтеза и дыхания, в результате чего понижается скорость образования восстановленных динуклеотидов и восстановленного ферредоксина, являющихся донорами электронов для восстановления нитратов, поэтому значительная часть нитратов остаётся невосстановленной и не используется для синтеза азотистых веществ растений. Аналогичное явление наблюдается в условиях пониженных температур, когда замедляются биосинтетические процессы, связанные с регенерацией доноров электронов для нитратвосстанавлива-ющей системы, тогда как поступление нитратов в растения продолжается, вследствие чего их концентрация в растительных тканях увеличивается.

Заметное влияние на функционирование нитратвосстанавливающей системы растений оказывает обеспеченность их микроэлементами – молибденом, железом, магнием, марганцем, медью, которые служат активаторами нитратредуктазы, нитритредуктазы и других ферментов азотного обмена. Особенно важна роль молибдена, входящего в состав молибденового кофермента нитратредуктазы. При недостатке молибдена и других микроэлементов замедляется процесс восстановления нитратов и происходит их накопление в растительных продуктах. Ещё большее накопление нитратов в растениях наблюдается при внесении избыточных доз азотных удобрений, а также при низкой обеспеченности растений фосфором и калием, когда формируется низкий урожай, и в этих условиях даже умеренные дозы азотных удобрений могут оказаться избыточными.

Принцип метода. Метод основан на колориметрическом определении нитритов, которые образуются из нитратов под действием фермента нитратредуктазы в соответствии с реакцией:

 

NO₃‾ + НАД× Н + Н⁺ ¾ ® NO₂‾ + НАД⁺ + Н₂О

 

Оборудование. Фарфоровые ступки с пестиками диаметром 8-10 см; лабораторные весы; фарфоровые чашки диаметром 6-8 см; марля для фильтрования, уложенная в 4 слоя; стеклянные пробирки на 20 мл со штативами; мерные колбы на 50, 100, 500, 1000 мл; конические колбы на 50 мл; дозирующие пипетки на 1-10 мл; термостат; фотоэлектроколориметр с набором кювет; дозирующее устройство для уксусной кислоты на 1 мл; стеклянные воронки диаметром 5 см; бумажные фильтры диаметром 6 см.

Реактивы. Дигидрофосфат натрия; гидрофосфат натрия; нитрат калия;

НАД∙ Н; концентрированная уксусная кислота; сульфат аммония; сульфаниловая кислота; α -нафтиламин; нитрит натрия; дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода).

Приготовление растворов. 0, 05 М фосфатный буфер (рН=8, 0): в 1 л дистиллированной воды растворяют 17, 911 г Na₂ HPO₄ ∙ 12Н₂ О; в 100 мл дистиллированной воды растворяют 0, 780 г NaН₂ РО₄ ∙ 2Н₂ О. Затем 53 мл раствора NaН₂ РО₄ ∙ 2Н₂ О смешивают с 947 мл раствора Na₂ HPO₄ ∙ 12Н₂ О.

0, 1 М раствор нитрата калия: 5, 055 г нитрата калия растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

0, 028 М раствор НАД∙ Н: 1, 86 г НАД∙ Н растворяют в 100 мл 0, 05 М фосфатного буфера.

10% раствор уксусной кислоты: 97, 1 мл концентрированной уксусной кислоты расворяют в 1 л дистиллированной воды.

Насыщенный раствор сульфата аммония: в 500 мл горячей воды (70°С) растворяют сульфат аммония до полного насыщения раствора, затем полученный раствор охлаждают, фильтруют и переливают в склянку для хранения.

Реактив Грисса: 4, 8 г сульфаниловой кислоты и 2, 4 г α -нафтиламина растворяют в 10%-ной уксусной кислоте и доводят объём раствора до 1 л.

Стандартный раствор нитрита натрия: 100 мг нитрита натрия расворяют в 1 л дистиллированной воды.

Ход определения. В фарфоровую ступку помещают 2 г растительного материала (проростки семян, вегетативная масса растений, клубни карто-феля, корнеплоды, овощи, плоды, ягоды) и растирают пестиком с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы. Затем в ступку приливают 20 мл фосфатного буферного раствора (рН=8, 0) и смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 15 минут. После этого полученную суспензию отжимают в фарфоровую чашку через 4 слоя марли и таким образом получают ферментный экстракт.

В ходе дальнейшего анализа отбирают дозирующей пипеткой 2 аликвоты ферментного экстракта по 2 мл и переносят в стеклянные пробирки на 20 мл. В одну из пробирок приливают 1 мл 10% раствора уксусной кислоты для инактивации фермента и содержимое пробирки перемешивают. Затем в эту же пробирку приливают 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония для осаждения белков и содержимое пробирки снова перемеши-вают. После этого в обе пробирки (с активным и инактивированным ферментом) приливают по 1 мл 0, 1 М раствора нитрата калия и 0, 028 М раствора НАД∙ Н, содержимое пробирок перемешивают и ставят на 30 минут в термостат при температуре 27°С. При этом фиксируют точное время начала ферментативной реакции.

По истечении указанного времени в пробирку с активным ферментом для его инактивации приливают 1 мл 10% раствора уксусной кислоты, а после перемешивания 3 мл насыщенного раствора сульфата аммония. Полученную смесь повторно перемешивают и отстаивают в течение 10 минут. В дальнейшем содержимое пробирок фильтруют в конические колбы на 50 мл. Из каждого фильтрата отбирают дозирующей пипеткой аликвоты по 5 мл и переносят в стеклянные пробирки. К фильтрату в каждой пробирке приливают по 1 мл реактива Грисса и содержимое пробирок перемешивают. Через 30 минут окрашенные растворы колориметрируют на фотоэлектроколориметре при длине волны 540 нм и толщине фотометри-руемого слоя 1 см.

Для построения градуировочного графика берут 10 мерных колб вмес-тимостью 50 мл и приливают 0, 1; 0, 2; 0, 3; 0, 4; 0, 5; 0, 6; 0, 7; 0, 8; 0, 9; 1, 0 мл исходного стандартного раствора нитрита натрия в каждую. Объёмы раство-ров в колбах доводят дистиллированной водой до метки и их содержимое перемешивают. Из каждой колбы пипеткой переносят в стеклянные пробир-ки по 5 мл раствора нитрата натрия и приливают по 1 мл реактива Грисса, содержимое пробирок перемешивают и через 30 минут колориметрируют окрашенные растворы на фотоэлектроколориметре. По полученным данным строят градуировочный график: на горизонтальной оси откладывают количество мкг нитрита натрия в 5 мл внесённого для окрашивания раствора, а на вертикальной оси – оптическую плотность окрашенных растворов.

Обработка и оценка результатов. Активность нитратредуктазы вычисляют по формуле:

 

М ∙ 20 ∙ 8

А = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ,

Н ∙ 2 ∙ 5 ∙ t

 

где А – активность нитратредуктазы в мкг нитрита натрия, который образу-ется под действием фермента за 1 час, в расчёте на 1 г растительной массы;

М – масса нитрита натрия, определённая по градуировочному графику на основе оптической плотности окрашенного раствора, мкг;

20 – объём ферментного экстракта, полученный из навески раститель-ного материала, мл;

8 – объём реакционной смеси при проведении ферментной реакции, мл;

Н – навеска растительного материала, г;

2 – объём ферментного экстракта, взятый для проведения фермента-тивной реакции, мл;

5 – объём фильтрата реакционной смеси, взятый для окрашивания с реактивом Грисса, мл;

t – время ферментной реакции в часах.

Полученный результат сравнивают с другими данными, характеризую-щими активность нитратредуктазы в разных растительных продуктах, выра-щенных при разном уровне азотного питания растений, при разной обеспе-ченности растений световой энергией и элементами питания. По уровню нитраредуктазной активности оценивают возможное содержание нитратов в растительной продукции.

 

Контрольные вопросы

1. Каковы строение и свойства ферментного белка нитратредуктазы?

2. Каков механизм действия нитратредуктазы?

3. Как различаются разные группы растений по уровню нитратредук-тазной активности?

4. Почему повышается содержание нитратов в растительной продукции при недостатке световой энергии и при низких температурах?

5. Почему повышается содержание нитратов в растительной продукции при избыточном азотном питании и недостатке других элементов питания?

6. Каковы принципы определения активности нитратредуктазы?

7. Как получают ферментный экстракт нитратредуктазы из растительной продукции?

8. В чём состоят особенности проведения ферментной реакции с участием нитратредуктазы?

9. Как определяется количество нитритов, образующихся под действием фермента нитратредуктазы?

10. Какова методика построения градуировочного графика при опре-делении активности нитратредуктазы?

11. Каковы принципы расчёта активности нитратредуктазы в расти-тельной продукции?

 

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Поделиться: