Определение активности пероксидаз в растительной

Продукции

При окислении в организмах кислородом органических субстратов в качестве основных продуктов образуются пероксид водорода (Н₂О₂) или органические пероксиды, которые могут окислять различные вещества. Одним из хорошо известных ферментов, способных катализировать реакции пероксидного окисления химических веществ в живых клетках, является пероксидаза (1.11.1.7.), которая с пероксидом водорода образует комплекс-ное соединение, в результате чего пероксид переходит в активированное состояние, превращаясь в акцептор водорода.

Растительные пероксидазы – двухкомпонентные ферменты, локализо-ванные главным образом в пероксисомах. В состав каталитического центра этих ферментов входит протогем. Действие пероксидазы можно представить в виде следующей реакции:

Субстрат–Н₂ + Н₂О₂ ® окисленный субстрат + 2Н₂О

Пероксидазы катализируют окисление пероксидом водорода феноль-ных соединений, жирных кислот, аминокислот и аминов, терпенов, восста-новленного глютатиона. Эти ферменты обладают высокой термоустойчи-востью, поэтому после стерилизации растительной продукции тепловой обработкой для последующего хранения и переработки в ней контролируется активность пероксидаз. При ферментации чая и табака пероксидазы наряду с полифенолоксидазами участвуют в образовании окрашенных и ароматизи-рующих веществ в составе этих продуктов.

Принцип метода.Определение активности пероксидаз в растительной продукции основано на проведении ферментативной реакции окисления пирогаллола пероксидом водорода с образованием окрашенного соединения пурпурогаллина, количество которого оценивают колориметрированием на фотоэлектроколориметре.

Оборудование.Ступки фарфоровые с пестиками диаметром 8-10 см или гомогенизатор; марля для фильтрования, уложенная в 4 слоя; чашки фарфоровые диаметром 6-8 см; колбы конические на 50 мл; дозирующие пипетки на 1-10 см; дозирующее устройство на 5 мл для раствора серной кислоты; мерные колбы на 100 мл и на 1 л с пробками; тёмная склянка для раствора пероксида водорода; термостат, фотоэлектроколориметр.

Реактивы.Дистиллированная вода (свободная от диоксида углерода); концентрированный раствор пероксида водорода; концентрированная серная кислота; 0, 05 М фосфатный буфер (рН=7, 0); пирогаллол.

Приготовление растворов.1% раствор пероксида водорода: готовится свежий раствор перед каждым анализом путём разбавления концентрирован-ного раствора в мерной колбе на 100 мл. Приготовленный раствор перелива-ют в тёмную склянку.

10% раствор серной кислоты: в фарфоровый стакан на 500 мл наливают 300 мл дистиллированной воды, к которой с помощью дозирующего устройстваприливают 60, 6 мл концентрированной серной кислоты, полу-ченную смесь перемешивают и после охлаждения переливают в мерную колбу на 1 л, ополаскивая стакан дистиллированной водой. Затем объём раствора в колбе доводят водой до метки и перемешивают.

0, 05 М фосфатный буфер (рН=7, 0): в 1 л дистиллированной воды растворяют 17, 911 г Na₂ HPO₄ ∙ 12Н₂ О; в 500 мл дистиллированной воды растворяют 3, 901 г NaН₂ РО₄ ∙ 2Н₂ О. Затем 390 мл раствора NaН₂ РО₄ ∙ 2Н₂ О смешивают с 610 мл раствора Na₂ HPO₄ ∙ 12Н₂ О.

1% раствор пирогаллола: 5 г пирогаллола растворяют в 500 мл дистиллированной воды.

Ход определения.Навеску растительного материала 2 г (клубни картофеля, корнеплоды, проростки семян злаковых, зернобобовых, масличных культур, овощи, плоды и ягоды, вегетативная масса растений) взвешивают на лабораторных весах с точностью до 0, 01 г и растирают в ступке или измельчают в гомогенизаторе до получения однородной массы. В случае необходимости в ступку для лучшего растирания растительного материала добавляют небольшое количество чистого кварцевого песка. К измельчённому в ступке материалу приливают дозирующей пипеткой 20 мл 0, 05 М фосфатного буфера (рН=7, 0) для экстракции ферментного белка и полученную смесь интенсивно перемешивают пестиком в течение 10 минут. Затем в фарфоровую чашку помещают уложенную в 4 слоя марлю и на неё переносят измельчённый растительный материал из ступки, заворачивают края марлевой ткани и отжимают через 4 слоя марли растительный экстракт с растворённым ферментным белком в коническую колбу на 50 мл.

В ходе последующего анализа в 2 конические колбы на 50 мл дозирующей пипеткой вносят по 4 мл ферментного экстракта и в одну из колб для инактивации ферментного белка (контроль) с помощью дозирующего устройства приливают 5 мл 10% раствора серной кислоты, смесь перемешивают. После этого в обе колбы дозирующей пипеткой приливают по 5 мл 1% раствора пирогаллола и по 1 мл 1% раствора пероксида водорода, смеси перемешивают и помещают на 15 минут в термостатированную камеру при температуре 25°С. Реакция проводится в отсутствие света, который активизирует самопроизвольный распад пероксида водорода на кислород и воду. Отсчёт времени ферментативной реакции начинается в тот момент, когда к ферментному раствору приливается раствор пероксида водорода. По истечении 15 минут теперь уже в колбу с активным ферментом для его инактивации приливается 5 мл 10% раствора серной кислоты и в этот момент фиксируется точное время прекращения ферментативной реакции.

После проведения ферментативной реакции окрашенные растворы образующимся под действием пероксидаз пурпурогаллином колориметриру-ют на фотоэлектроколориметре с использованием зелёного светофильтра при толщине фотометрируемого слоя 5 мм.

Обработка и оценка результатов.Активность пероксидаз рассчиты-вают по формуле:

(D₁ -D₂ ) ∙ 20

А = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ,

Н ∙ 4 ∙ t

 

где А – активность пероксидаз в единицах оптической плотности раствора пурпурогаллина, образовавшегося за 1 час под действием этих ферментов в расчёте на 1 г растительной массы;

D₁ – оптическая плотность раствора в варианте с активными пероксидазами;

D₂ – оптическая плотность раствора в варианте с инактивированными пероксидазами;

20 – объём ферментного экстракта, выделенного из растительной пробы, мл;

Н – навеска растительного материала, г;

4 – объём экстракта пероксидаз, взятый для проведения ферментативной реакции;

t – время ферментативной реакции в часах.

Полученный результат сравнивают с другими определениями пероксидазной активности в различных растительных образцах и дают оценку происходящих в них биохомических процессов.

 

Контрольные вопросы

1. Каковы строение и механизм действия фермента пероксидазы?

2. Окисление каких веществ катализируют пероксидазы?

3. Какое значение имеют пероксидазы в обмене веществ организмов?

4. В чём состоят принципы определения каталитической активности пероксидаз?

5. Как выделяют пероксидазы из растительного материала и каковы особенности проведения ферментативной реакции пероксидного окисления пирогаллола?

6. Как проводят колориметрирование окрашенного раствора пурпурогаллина, образовавшегося под действием пероксидаз?

7. Каковы принципы расчёта активности пероксидаз?

8. Как можно использовать сведения об активности пероксидаз при оценке биохимических процессов в растениях и качества растительной продукции?

Определение аскорбиновой кислоты в растительной

Продукции йодатным методом

 

Аскорбиновая кислота (витамин С) проявляет биологическую активность в виде L- стереоизомера, синтезируется из глюкозы или галактозы и в водном растворе имеет кислотные свойства вследствие диссоциации отмеченного в формуле кружочком протона одного из енольных гидроксилов.

Основная функция аскорбиновой кислоты – участие в качестве восста-навливающего агента в реакциях гидроксилирования, в ходе которых проис-ходит включение кислорода воздуха в органические субстраты, при этом аскорбиновая кислота окисляется с образованием дегидроаскорбиновой кис-лоты. Дегидроаскорбиновая кислота также обладает витаминной актив-ностью, так как очень легко превращается в аскорбиновую кислоту. Благо-даря легкой окисляемости аскорбиновая кислота предохраняет от окисления другие соединения.

Аскорбиновая кислота повышает устойчивость организма человека к инфекции и простудным заболеваниям. Длительное отсутствие в пище человека витамина С приводит к заболеванию цингой. Для поддержания нормальных функций организма рекомендуется ежедневная норма витамина 30-70 мг.

Аскорбиновая кислота не синтезируется организмами человека, обезь-яны и морской свиньи, тогда как другие животные и птицы способны к синтезу этого витамина. Однако в ряде опытов показано, что добавление в зимний период аскорбиновой кислоты в кормовые рационы сельскохозяй-ственных животных существенно повышает их рост и продуктивность.

Богаты аскорбиновой кислотой листья растений, свежие овощи, плоды и ягоды. Ниже показано содержание витамина С в некоторых растительных продуктах, мг%:

Черная смородина	100-400	Лимон	40-60
Шиповник	1000-4000	Перец сладкий	100-400
Капуста: белокочанная	20-60	Баклажаны Кабачки	2-10 10-15
Цветная	50-150	Щавель	50-70
Картофель	10-25	Редис	20-30
Морковь	5-10	Столовая свекла	5-20
Томаты	20-30	Виноград	1-5
Лук зеленый	40-60	Зеленый горошек	30-50
Огурец	2-10	Кормовая свекла	3-6
Петрушка	100-200	Кормовые травы перед цветением	40-60
Укроп	150-200	Молодая зелень (в
Яблоки	5-30	расчете на сухую
Вишня	5-15	массу)	400-500
Земляника	40-60	Брусника	100-200
Малина, красная смородина	20-40	Молоко	1-2

Аскорбиновая кислота очень активно синтезируется в листьях расте-ний. Особенно много её в молодой зелени. В ходе онтогенеза содержание аскорбиновой кислоты в листьях постепенно снижается, а после цветения резко уменьшается вследствие усиления гидролитических процессов. Кон-центрация аскорбиновой кислоты в растительной продукции зависит от природно-климатических условий, а также обеспеченности растений пита-тельными элементами.

Многие плоды и ягоды, выращенные в южных регионах, накапливают значительно меньше витамина С, чем при их возделывании в более северных районах, что обусловлено особенностями погоды. Как показывают опыты, в условиях прохладного лета в листьях и плодах растений синтезируется больше аскорбиновой кислоты, чем при жаркой и засушливой погоде. Томаты, выращенные в открытом грунте, богаче аскорбиновой кислотой, чем выросшие в теплице. Однако указанная закономерность по-видимому не является универсальной. Известны плодово-ягодные культуры, которые способны больше накапливать аскорбиновой кислоты в условиях южных регионов – груши, айва, абрикосы, персики, черника, земляника и др.

Концентрация витамина С резко снижается при ухудшении режима питания растений макро- и микроэлементами, а также при нарушении агротехники возделывания культуры. Снижение содержания этого витамина происходит при избыточном азотном питании. Содержание аскорбиновой кислоты в плодоовощной продукции может снижаться в процессе хранения, в наибольшей степени это характерно для картофеля (в 1, 5-2 раза) и в меньшей степени для цитрусовых. Особенно сильно понижается концен-трация витамина С при нарушении технологических режимов хранения.

Значительные потери аскорбиновой кислоты могут наблюдаться при варке, сушке и переработке растительных продуктов. Это обусловлено тем, что она является очень нестойким соединением, которое довольно легко подвергается разрушению под воздействием окислителей (окислительные ферменты, следы меди или железа), повышенной температуры и солнечных лучей, щелочного гидролиза. Почти полное разрушение витамина С происходит при естественной сушке сена в полевых условиях. Некоторые вещества являются стабилизаторами витамина С, к ним относятся белки, аминокислоты, поваренная соль, сахара, крахмал, жиры. Каротиноиды предотвращают переход аскорбиновой кислоты в дегидроформу.

В растительной продукции аскорбиновая кислота содержится в трёх формах – в виде восстановленной формы (аскорбиновая кислота), окислен-ной формы (дегидроаскорбиновая кислота) и в виде аскорбиногенов, в которых аскорбиновая кислота связана с другими соединениями и может высвобождаться при гидролизе. В зрелых плодах и овощах преимущественно накапливается восстановленная форма аскорбиновой кислоты, а в незрелых и перезрелых продуктах возрастает доля дегидроаскорбиновой кислоты, кото-рая менее устойчива к действию окислителей и поэтому больше теряется при хранении и переработке плодоовощной продукции. В капусте значительная часть аскорбиновой кислоты содержится в виде аскорбиногена, поэтому при хранении данного продукта потери витамина небольшие. В квашеной капусте аскорбиновая кислота также хорошо сохраняется, так как образующаяся молочная кислота повышает стабильность этого витамина.

Методы определения аскорбиновой кислоты в растительной продукции основаны на её редуцирующих свойствах. Одним из них является йодатный метод.

Принцип метода.При определении витамина С этим методом проводится реакция восстановления аскорбиновой кислотой йодата калия до свободного йода, который окрашивают при добавлении раствора крахмала и количественно оценивают.

Оборудование.Ступки фарфоровые с пестиками диаметром 8-10 см; мерные колбы на 100 мл; воронки диаметром 6-8 см; колбы конические на 100 мл; дозирующие пипетки на 1-10 мл; цилиндры мерные на 25 мл; стаканы стеклянные на 100 мл; микробюретка, лабораторные весы.

Реактивы.Соляная кислота концентрированная; йодистый калий; йодат калия; водорастворимый крахмал; дистиллированная вода.

Приготовление растворов.2% раствор соляной кислоты: 45, 5 мл НCl (плотность 1, 19 г/см³ ) растворяют в 1л дистиллированной воды.

1% раствор йодистого калия: 1 г KI растворяют в 100 мл дистиллированной воды.

0, 001 н раствор йодата калия: 0, 3567 г KIO₃ растворяют в 1 л дистилли-рованной воды и затем готовят рабочий раствор путём разбавления в 10 раз полученного исходного раствора.

0, 5% раствор крахмала: 0, 5 г водорастворимого крахмала разводят в 20 мл холодной дистиллированной воды и полученную смесь приливают в стакан с 80 мл горячей воды (80°С), затем при помешивании содержимое стакана нагревают до полного растворения крахмала.

Ход определения.Навеску растительного материала 5 г растирают в фарфоровой ступке с небольшим количеством кварцевого песка до получения однородной массы и количественно переносят дистиллированной водой в мерную колбу на 100 мл (несколько раз ополаскивая ступку и пестик водой), доводятобъём смеси в колбе до метки и содержимое колбы тщательно перемешивают. Затем полученную смесь фильтруют через сухой фильтр в коническую колбу на 100 мл. Фильтрат сразу же используется для дальнейшего анализа и не подлежит хранению.

После этого дозирующей пипеткой отбирают 10 мл фильтрата и переносят в коническую колбу на 100 мл. Затем к фильтрату, содержащему аскорбиновую кислоту, приливают 1 мл 2% раствора соляной кислоты, 0, 5 мл 1% раствора йодистого калия, 2 мл 0, 5% раствора крахмала и 10 мл дистиллированной воды. Полученную смесь перемешивают и титруют из микробюретки 0, 001 н раствором йодата калия до появления синего окрашивания. Одновременно с анализируемой пробой проводится титрова-ние смеси используемых реактивов, в которую вместо фильтрата, содержа-щего аскорбиновую кислоту, приливают 10 мл дистиллированной воды.

Обработка и оценка результатов.Содержание аскорбиновой кислоты рассчитывают по формуле:

(V₁ - V₂ ) ∙ K ∙ 0, 08806 ∙ 100

С = ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ¾ ,

Н

где С – содержание аскорбиновой кислоты в 100 г растительного материала в мг (мг%);

V₁ – объём раствора йодата калия, затраченный на титрование раствора аскорбиновой кислоты, мл;

V₂ – объём раствора йодата калия, затраченный на титрование смеси реактивов, мл;

К – поправка к титру раствора йодата калия;

0, 08806 – коэффициент пересчёта мл 0, 001 н раствора йодата калия в мг аскорбиновой кислоты;

100 – коэффициент пересчёта в мг%;

Н – масса растительного материала, соответствующая 10 мл раствора аскорбиновой кислоты, г (учитывая, что общий объём раствора аскорбиновой кислоты 100 мл, а взято для дальнейшего анализа 10 мл, указанная масса составляет десятую часть от исходной навески растительного материала).

Полученный результат сравнивают с теоретическими сведениями о содержании аскорбиновой кислоты в различной растительной продукции с учётом влияния на этот показатель природно-климатических условий, режима питания растений, способа и срока её хранения и делают выводы о качестве анализируемого растительного продукта.

Контрольные вопросы

1. Какова биологическая роль аскорбиновой кислоты в организмах растений, человека и животных?

2. Сколько содержится аскорбиновой кислоты в клубнях картофеля, корнеплодах, овощах, плодах и ягодах, вегетативной массе кормовых трав?

3. Как изменяется содержание аскорбиновой кислоты в листьях растений в процессе их роста и развития?

4. Как влияют на содержание аскорбиновой кислоты в растениях природно-климатические условия?

5. Каково влияние режима питания растений на накопление аскорбиновой кислоты в растительной продукции?

6. При каких условиях происходят потери аскорбиновой кислоты?

7. Что такое аскорбиногены?

8. Как определяют содержание аскорбиновой кислоты в растительной продукции?

9. Какая реакция происходит при титровании раствора аскорбиновой кислоты раствором йодата калия?

10. По какому принципу ведётся расчёт содержания аскорбиновой кислоты при её определении йодатным методом?

 

⇐ Предыдущая12345678910

Поделиться: