ФРУКТОЗО-1,6-БИСФОСФАТАЛЬДОЛАЗА КЛАССА I

ФРУКТОЗО-1, 6-БИСФОСФАТАЛЬДОЛАЗА КЛАССА I

КАК БЕЛОК ОТВЕТА НА СТРЕСС В E.COLI

(Обзор литературы + исследовательский проект)

Курсовая работа

по химической биологии

студентки 110 группы

Гасановой Д.А.

 

Научный руководитель:

к.х.н., доцент

Москва 2012 г.

Родина Е.В.

Оглавление

		Стр.
	Список использованных сокращений
1.	Введение
2.	Обзор литературы: Фруктозо-1, 6-бисфосфатальдолаза класса I как возможный белок ответа на стресс в Е. coli
2.1.	Классификация альдолаз
2.2.	Экспрессия FbaB в различных организмах
2.3.	Предполагаемые функции FbaB в бактериальной клетке
3.	Исследовательский проект: Выявление функциональной роли фруктозо-1, 6-бисфосфатальдолазы класса I в E.coli
3.1.	Определение видов стресса, в ответе на которые в E.coli может участвовать FbaB
3.2.	Определение экспрессии FbaB на разных стадиях клеточного цикла
3.3.	Определение каталитической активности FbaB на разных стадиях клеточного цикла
3.4.	Локализация пространственного распределения FbaB в клетке
3.5.	Выявление белковых партнёров FbaB в E.coli
4.	Экспериментальная часть: Влияние нокаута гена FbaB на адаптацию E.coli к различным видам стресса
4.1.	Оборудование и реактивы
4.2.	Методики
4.3.	Результаты
5.	Список литературы

 

Список использованных сокращений.

FbaA – фруктозо-1, 6-бифосфатальдолаза класса II (белок)

FbaB – фруктозо-1, 6-бифосфатальдолаза класса I (белок)

fbaB – ген, кодирующий FbaB

Δ fbaB – штамм клеток E.coli с нокаутом гена fbaB

WT – нативный штамм E.coli

FBP­­– фруктозо-1, 6-бисфосфат

GFP – зелёный флюоресцентный белок

LB – среда Луриа-Бертани, стандартная для культивирования клеток E.coli

ЭДТА ­– этилендиаминтетраацетат

 

Введение

Фруктозо-1, 6-бисфосфатальдолазы – ферменты, участвующие в гликолизе и глюконеогенезе. Они присутствуют во всех известных живых организмах и подразделяются на два класса, I и II, различающиеся по структуре и механизму каталитического действия. Большинство эубактерий в качестве основной (или единственной) гликолитической альдолазы используют белок FbaA, то есть альдолазу класса II. Однако в геномах некоторых бактерий, включая E.coli, имеется также ген альдолазы класса I, или FbaB. В нормальных условиях роста эта альдолаза является минорной формой. Повышенная экспрессия FbaBнаблюдается в стрессовых условиях: при недостатке питательных веществ или воды в питательной среде, при переходе в стационарную фазу роста и т.п. Этот факт позволяет предположить, что FbaB в этих видах бактерий, помимо основной каталитической функции, выполняет также роль адаптивного белка, помогающего бактерии выживать в стрессовых условиях. В данной работе приведен обзор литературы и предложен проект исследования с целью выяснить, в каких именно видах стресса участвует FbaB, а также выявить другие возможные функции этого фермента в E.coli.

 

ФРУКТОЗО-1, 6-БИСФОСФАТАЛЬДОЛАЗА КЛАССА I

КАК БЕЛОК ОТВЕТА НА СТРЕСС В E.COLI

(Обзор литературы)

Классификация альдолаз.

Альдолазы – группа ферментов, относящихся к классу лиаз и катализирующих реакции альдольного расщепления. Фруктозо-1, 6-бифосфатальдолазы (Fba), в частности, отвечают за разложение фруктозо-1, 6-бифосфата (FBP, рис. 1), реакцию первой фазы гликолиза. Обратная реакция, также катализируемая этими ферментами, является одной из стадий глюконеогенеза – синтеза глюкозы из неуглеводных источников.

 

Рис. 1. Реакция, катализируемая фруктозо-1, 6-бисфосфатальдолазой.

 

Рис. 2. Схема каталитического действия альдолазы класса I.

 

Альдолазы как таковые делятся на два принципиально различных и, очевидно, генетически не родственных класса, I (FbaB) и II (FbaA). Ферменты обоих классов катализируют депротонирование гидроксильной группы и последующий разрыв связи C-C. Разница между ними состоит в механизме атаки на субстрат - FBP. В реакции с участием альдолазы класса I формируется основание Шиффа между карбонильной группой FBP и аминогруппой остатка лизина в активном центре фермента (Рис. 2). Сдвиг электронной плотности позволяет соседней OH-группе депротонироваться, что приводит к расщеплению связиС-С. В альдолазах класса II роль электрофильного реагента, поляризующего карбонильную группу, выполняет двухвалентный катион, как правило, Zn²⁺, который содержится в молекуле фермента.

Различие в механизме позволяет дифференциально определять активность альдолаз двух классов, используя селективные ингибиторы. Ингибиторами для альдолаз класса I являются восстановители, превращающие основание Шиффа в устойчивую связь, а для альдолаз класса II – комплексообразователи, связывающие кофакторный ион металла в прочный комплекс [1].

 

Оборудование и реактивы.

Культуры штаммов E.coli, нокаутных по следующим генам: fbaB, gadA, kduI, lpd, ulaB, а также культуру контрольного нативного штамма E.coli брали из библиотеки модифицированных штаммов (…). Для приготовления среды LB применяли готовую сухую смесь реагентов. Клеточные культуры выращивали в инкубируемом шейкере фирмы (…). Измерения светопоглощения вели на спектрофотометре Pharmacia LKB Ultrospec Plus.

Методики.

1. Выращивание ночной культуры. Для выращивания ночной культуры готовили среду LB из расчёта 1 г готовой смеси экстрактов на 40 мл дистиллированной H₂O. Среду стерилизовали автоклавированием в течение 1 часа. В стерильные бакпечатки помещали по 1, 5 мл стерилизованной среды. В 5 из них (кроме контрольной) добавлялось по 3 мкл 25 % раствора канамицина. Заражали среду соответствующим штаммом и инкубировали в течение ночи при 37˚ С при перемешивании.

2. Выращивание культуры штаммов E.coli в нормальных условиях. В стерильные пробирки помещали по 3, 5 мл стерильной среды LB, добавляли в каждую по 25 мкл ночной культуры соответствующего штамма и ставили в инкубируемый шейкер на 37˚ С. После 2 часов инкубации каждые 20-25 мин из пробирки отливали около 1 мл клеточной суспензии и измеряли светопоглощение при длине волны 600 нм. Строили графики зависимости D₆₀₀ от времени инкубации и по прямым участкам определяли тангенс угла наклона, соответствующий скорости роста культуры данного штамма.

3. Выращивание культуры штаммов E.coli в стрессовых условиях. Опыт проводили аналогично п. 2, за исключением состава среды. В первом варианте (сильнокислая среда) брали по 4, 5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 6, 1, и добавляли в каждую по 30 мкл ночной культуры соответствующего штамма. Во втором варианте (умеренно кислая среда) брали по 4, 5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 4, 5.

 

Результаты.

В экспериментальной части работы удалось измерить только скорости роста штаммов E.coli в нормальных и слабокислых условиях, т.к. в сильнокислой среде, по-видимому, к концу времени измерения клеточные культуры не успели выйти из индукционного периода. Графики полученных зависимостей для контрольного штамма и Δ fbaB показаны на Рис. 3. Тангенсы угла наклона прямых участков составили: (…) Из полученных результатов можно сделать вывод, что альдолаза I класса FbaB не нужна клеткам E.coli ни для роста в нормальных условиях, ни для адаптации к слабокислой среде.

а)	б)
Рис. 3. Рост клеток нативного штамма E.coli (красными кружочками) и Δ fbaB в нормальных условиях (а) и при рН 6, 1 (б).

 

 

Список литературы

1. Rutter, W.J. (1964) Fed.Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 23, 1248-1257.

2. Stribling, D. & Perham, R.N. (1973) Biochem. J., 131, 833-841.

3. Bai, N.J., Pai, M.R., Murthy, P.S. & Venkitasubramanian, T.A. (1974) Arch. Biochem. Biophys., 168, 230-234.

4. Grazi, E., Meloche, Ii., Martinez, G., Wood, W. A., and Horecker, B. L. (1963) Biochem. Biophys. Res. CoBPun., 2, 4.

5. DeVries, G.H., Binkley, S.B.(1972)Arch.Biochem.Biophys., 151(1), 234–242.

6. Baldwin, S.A. & Perham, R.N. (1978) Biochem. J., 169, 643-652.

7. Thomson, G.J., Howlett, G.J., Ashcroft, A.E. & Berry, A. (1998) Biochem. J., 331: 437-445.

8. Tani, T.H., Khodursky, A., Blumenthal, R.M., Brown, P.O. & Matthews, R.G. (2002) PNAS, 99 (21), 13471-13476.

9. Rosenkrands, I., Slayden, R.A., Crawford, J., Aagaard, C., Clifton E. Barry III & Anderson, P. (2002) Journal of Bacteriology, 184 (13), 3485-3481.

10. Zhang, J., Sprung, R., Pei, J., Tan, X., Kim, S., Zhu, H., Liu, C.F., Grishin, N.V., Zhao, Y. (2009) Mol. Cell. Proteomics 8, 215-225.

 

 

ФРУКТОЗО-1, 6-БИСФОСФАТАЛЬДОЛАЗА КЛАССА I

123Следующая ⇒

Поделиться: