Определение активности FbaB на разных стадиях клеточного цикла

Измерение альдолазной активности в пробе WT культуры в разные моменты времени планируется проводить следующим образом: отобранная проба клеток будет лизирована, клеточный дебрис удален центрифугированием, к клеточному экстракту будет добавлен ЭДТА – хелатор ионов металлов, ингибирующий альдолазу класса II, - и в аликвоте экстракта будет измерена альдолазная активность. В качестве контроля можно параллельно измерять активность в присутствии NaBH₄, который необратимо подавляет активность FbaB, но не влияет на активность альдолазы класса II (FbaА).

Для более полной характеристики того, каким образом FbaB участвует в адаптации клетки к стрессу, измерения уровня экспрессии и активности следует проводить:

- в контрольной культуре, условия роста которой отличаются от таковых у исследуемой пробы только отсутствием стрессового фактора;

- в начале индукционного периода, т.е. почти сразу после высева бактерий из ночной культуры в среду со стрессовым фактором;

- ближе к концу индукционного периода;

- в фазе экспоненциального роста.

 

Локализация пространственного распределения FbaB в клетке

Некоторые экспериментальные данные свидетельствуют о том, что FbaB может участвовать в образовании филаментов прокариотического цитоскелета, который необходим на начальных этапах синтеза клеточной стенки и во многом определяет форму клеток, а также на стадии клеточного деления. Поэтому в данный проект можно включить микроскопическое исследование формы клеток нативного и нокаутного штаммов, в частности, в тех условиях, в которых скорости их роста различаются. Для ещё более детального выяснения того, какова роль FbaB в E.coli, нужно сравнить штамм, нокаутный по FbaB, с нативным по ряду фенотипических признаков: размерам клеток, фактуре оболочки, двигательной способности, наличию пилей и т.п.

Необходимо также определить субклеточную локализацию FbaB на разных стадиях клеточного цикла. Для этого необходимо получить штамм клеток E.coli, в котором FbaBэкспрессировалась бы в виде фьюжн-белка с маркерным белком (в качестве которого можно взять зеленый флюоресцентный белок GFP). В библиотеке имеется плазмида с таким геном, поэтому в данном проекте достаточно трансформировать ее в подходящий штамм и подобрать условия ненулевой экспрессии. Выделять и очищать фьюжн-белок нет необходимости. Клеточную культуру этого штамма предполагается выращивать в базовых условиях (для сравнения) и в стрессовых условиях, в которых наблюдался замедленный рост нокаутного штамма. На разных стадиях клеточного роста препараты этого штамма будут проанализированы методом электронной микроскопии с флуоресцентной детекцией для локализации FbaB внутри клеток.

5. Выявление белковых партнёров FbaB в E.coli

Очевидно, FbaB в клетке взаимодействует с рядом белковых партнёров. Те из них, синтез которых регулируется общим репрессором или активатором (а также расположенные с FbaB в одном опероне), можно обнаружить измерением уровня экспрессии различных белков в FbaB-нокаутном штамме и в контроле. Это измерение производится с помощью специального протеомного анализа, основанного на выделении и разделении суммарного белкового препарата для двух разных штаммов. Разделение проводится с помощью двумерного гель-электрофореза, белковые пятна прокрашиваются специальными флуорогенными красителями, после чего идентичные по положению пятна в двух штаммах сравниваются по интенсивности. Различие в экспрессии более чем в 2 раза может указывать на функциональную связь данного белка и FbaB.

Для выявленных белков можно получить (или использовать готовые) штаммы, нокаутные по их гену, и протестировать их на отношение к стрессу. Если культура нокаутного по изучаемому белку штамма замедляет рост при тех же условиях, что и нокаутнаяпо FbaB, то можно с большей уверенностью утверждать, что данный белок функционально связан с FbaB в ходе ответа на этот стресс.

Для выявленных функциональных партнеров FbaB необходимо будет провести эксперименты, доказывающие их физическое взаимодействие. Для этого можно использовать, например, метод металлоаффинной хроматографии: один из белков- партнеров экспрессируют с аффинным тагом (например, вставкой из шести остатков His на конце полипептидной цепи), смешивают с вторым белком и наносят на колонку с аффинным сорбентом (например, Ni-хелатирующей смолой). В случае физического взаимодействия между белками они оба будут удерживаться на смоле и смываться с нее только при особых условиях (например, высокой концентрации имидазола).

 

Данное исследование позволит более определённо указать роль FbaB в жизнедеятельности E.coli в условиях того или иного стресса, а также, возможно, выяснить ее участие в других клеточных процессах. Сведения о функции FbaB как стрессового белка могут послужить основой для выдвижения гипотез о конкретных механизмах реакции клетки на стресс. Это поможет открыть и исследовать химические процессы, к катализу или регуляции которых способен этот фермент invivo, что может послужить основой для создания новых антибактериальных средств.

 

 

Влияние нокаута гена fbaB на адаптацию E.coli к различным видам стресса.

 

(Экспериментальная часть)

 

В данной работе был начат эксперимент по изучению выживаемости штамма E.coli с нокаутом гена fbaB (Δ fbaB) в условиях стресса. В качестве контроля использовали нативный штамм, а также ряд штаммов с нокаутом генов известных стрессовых белков.

Оборудование и реактивы.

Культуры штаммов E.coli, нокаутных по следующим генам: fbaB, gadA, kduI, lpd, ulaB, а также культуру контрольного нативного штамма E.coli брали из библиотеки модифицированных штаммов (…). Для приготовления среды LB применяли готовую сухую смесь реагентов. Клеточные культуры выращивали в инкубируемом шейкере фирмы (…). Измерения светопоглощения вели на спектрофотометре Pharmacia LKB Ultrospec Plus.

Методики.

1. Выращивание ночной культуры. Для выращивания ночной культуры готовили среду LB из расчёта 1 г готовой смеси экстрактов на 40 мл дистиллированной H₂O. Среду стерилизовали автоклавированием в течение 1 часа. В стерильные бакпечатки помещали по 1, 5 мл стерилизованной среды. В 5 из них (кроме контрольной) добавлялось по 3 мкл 25 % раствора канамицина. Заражали среду соответствующим штаммом и инкубировали в течение ночи при 37˚ С при перемешивании.

2. Выращивание культуры штаммов E.coli в нормальных условиях. В стерильные пробирки помещали по 3, 5 мл стерильной среды LB, добавляли в каждую по 25 мкл ночной культуры соответствующего штамма и ставили в инкубируемый шейкер на 37˚ С. После 2 часов инкубации каждые 20-25 мин из пробирки отливали около 1 мл клеточной суспензии и измеряли светопоглощение при длине волны 600 нм. Строили графики зависимости D₆₀₀ от времени инкубации и по прямым участкам определяли тангенс угла наклона, соответствующий скорости роста культуры данного штамма.

3. Выращивание культуры штаммов E.coli в стрессовых условиях. Опыт проводили аналогично п. 2, за исключением состава среды. В первом варианте (сильнокислая среда) брали по 4, 5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 6, 1, и добавляли в каждую по 30 мкл ночной культуры соответствующего штамма. Во втором варианте (умеренно кислая среда) брали по 4, 5 мл стерильной среды LB, подкисленной 6 M HCl до pH 4, 5.

 

Результаты.

В экспериментальной части работы удалось измерить только скорости роста штаммов E.coli в нормальных и слабокислых условиях, т.к. в сильнокислой среде, по-видимому, к концу времени измерения клеточные культуры не успели выйти из индукционного периода. Графики полученных зависимостей для контрольного штамма и Δ fbaB показаны на Рис. 3. Тангенсы угла наклона прямых участков составили: (…) Из полученных результатов можно сделать вывод, что альдолаза I класса FbaB не нужна клеткам E.coli ни для роста в нормальных условиях, ни для адаптации к слабокислой среде.

а)	б)
Рис. 3. Рост клеток нативного штамма E.coli (красными кружочками) и Δ fbaB в нормальных условиях (а) и при рН 6, 1 (б).

 

 

Список литературы

1. Rutter, W.J. (1964) Fed.Proc. Fed. Amer. Soc. Exp. Biol., 23, 1248-1257.

2. Stribling, D. & Perham, R.N. (1973) Biochem. J., 131, 833-841.

3. Bai, N.J., Pai, M.R., Murthy, P.S. & Venkitasubramanian, T.A. (1974) Arch. Biochem. Biophys., 168, 230-234.

4. Grazi, E., Meloche, Ii., Martinez, G., Wood, W. A., and Horecker, B. L. (1963) Biochem. Biophys. Res. CoBPun., 2, 4.

5. DeVries, G.H., Binkley, S.B.(1972)Arch.Biochem.Biophys., 151(1), 234–242.

6. Baldwin, S.A. & Perham, R.N. (1978) Biochem. J., 169, 643-652.

7. Thomson, G.J., Howlett, G.J., Ashcroft, A.E. & Berry, A. (1998) Biochem. J., 331: 437-445.

8. Tani, T.H., Khodursky, A., Blumenthal, R.M., Brown, P.O. & Matthews, R.G. (2002) PNAS, 99(21), 13471-13476.

9. Rosenkrands, I., Slayden, R.A., Crawford, J., Aagaard, C., Clifton E. Barry III & Anderson, P. (2002) Journal of Bacteriology, 184(13), 3485-3481.

10. Zhang, J., Sprung, R., Pei, J., Tan, X., Kim, S., Zhu, H., Liu, C.F., Grishin, N.V., Zhao, Y. (2009) Mol. Cell. Proteomics 8, 215-225.

 

 

⇐ Предыдущая123

Поделиться: