Кислотный гидролиз крахмала и идентификация продуктов гидролиза

 

Цель работы: на примере кислотного гидролиза крахмала изучить процесс последовательной деполимеризации полисахарида. Провести хроматографический анализ гидролизата, идентифицировать продукты гидролиза.

Реактивы и оборудование:

1) крахмальный клейстер;

2) 10%-ный раствор серной кислоты;

3) 0, 1 н раствор йода в KI;

4) пластинки «Силуфол» для ТСХ;

5) разделяющая система растворителей;

6) реагент для проявления пластинок;

7) вода дистиллированная;

8) стаканы химические на 50 мл;

9) штатив с калиброванными пробирками на 10 мл;

10) пипетки;

11) стеклянная палочка;

12) хроматографическая камера;

13) термостат;

14) весы лабораторные;

15) мерный цилиндр на 25 мл.

Опыт 4.1 Приготовление крахмального клейстера.

В химическом стакане растворяют 1, 5 г крахмала в 25 мл дистиллированной воды и доводят до кипения при интенсивном перемешивании стеклянной палочкой.

 

Опыт 4.2 Гидролиз крахмала.

При нагревании крахмала с разбавленными кислотами происходит его гидролиз по следующей схеме:

(С₆Н₁₀О₅)_х ® (С₆Н₁₀О₅)_y ® С₁₂Н₂₂О₁₁ ® С₆Н₁₂О₆

крахмал декстрины мальтоза глюкоза

где у < х.

 

В мерную пробирку помещают 2 мл крахмального клейстера и 6 капель раствора серной кислоты. Содержимое пробирки встряхивают и ставят в стакан на 50 мл с кипящей водой. Каждые 2 минуты отбирают пипеткой каплю раствора и переносят в пробирку с раствором йода. Для этого предварительно в 8 пробирок помещают по одной капле раствора йода и 5 капель воды.

Последовательные пробы обнаруживают постепенное изменение окраски при реакции с йодом (синюю, сине-фиолетовую, красно-фиолетовую, красновато-оранжевую, оранжевую и желтую).

Крахмал с йодом дает синее окрашивание. Декстрины, в зависимости от величины цепочки, с йодом окрашиваются в фиолетовые, красные и оранжевые цвета. Мальтоза и глюкоза не изменяют окраски йода.

Гидролиз крахмала заканчивают, когда крахмальный клейстер не будет давать цветной реакции с йодом. Отмечают общую продолжительность гидролиза.

По окончании гидролиза проводят анализ реакционной среды методом ТСХ.

 

Опыт 4.3 Метод ТСХ.

На подготовленную пластинку ТСХ «Силуфол» с помощью хроматографического шприца наносят 1 мкл гидролизата в виде сплошной полосы длиной 2-7 мм, отступая от бокового и нижнего краев пластинки на расстояние 10 мм. Пластинку вертикально помещают в камеру, которая заполнена разделяющей смесью до высоты 5 мм. Состав разделяющей смеси: н-бутанол - уксусная кислота - вода (60 мл - 15 мл - 25 мл). Пластинку выдерживают в камере до тех пор, пока высота подъема фронта восходящего растворителя не достигнет отмеченной длины разделительного пути. Разделительный путь (расстояние от линии старта до фронта растворителя) равен 90 мм.

По окончании хроматографического разделения пластинку вынимают из камеры и сушат при комнатной температуре в вытяжном шкафу до полного испарения остатков растворителей.

Затем разделение повторяют в той же системе растворителей. Высушенные пластинки погружают в реагент, представляющий собой смесь: н-бутанол - водоуксусная кислота - фосфорная кислота – анилин - дифениламин (60 мл - 25 мл - 15 мл - 10 мл - 1 мл - 2 г). Пластинки снова сушат и проявляют в термостате при температуре 120⁰С в течение 5 мин.

Идентификацию продуктов гидролиза проводят с помощью свидетелей и по значениям R_f. Данные заносят в таблицу 3.

 

Таблица 3.

№ п/п	Название компонента смеси	Rf	Цвет пятна
	Декстрины
	Мальтоза
	Глюкоза

Вопросы для контроля.

1. Строение ди- и полисахаридов.

2. Химические свойства дисахаридов.

3. Строение крахмала и гликогена.

4. Строение клетчатки.

5. Гидролиз полисахаридов. Кислотный гидролиз крахмала. Какие продукты образуются при гидролизе? Недостатки кислотного гидролиза.

6. Гидролиз крахмала амилолитическими ферментами: a- и b-амилазами, глюкозоамилазой. Особенности ферментативного гидролиза крахмала.

7. Какую окраску с йодом дают крахмал, декстрины, мальтоза и глюкоза?

8. На чем основано хроматографическое разделение смеси веществ? Что такое элюент? Как рассчитывается величина R_f?

 

Упражнения по теме «Дисахариды и полисахариды»

1. Напишите уравнение реакции получения следующих дисахаридов:

а) лактозы; б) мальтозы.

2. Напишите уравнение реакций взаимодействия:

а) хлористого пропионила с лактозой;

б) бромистого ацетила с целлобиозой.

Назовите продукты реакций.

3. Напишите уравнение реакции окисления дисахаридов в мягких условиях:

а) мальтозы; б) целлобиозы; в) лактозы.

Назовите образующиеся кислоты.

4. Напишите уравнения реакций взаимодействия метилового спирта (в присутствии катализатора HCl):

а) с мальтозой; б) с лактозой.

Назовите полученные соединения.

5. Напишите схему образования озазона лактозы.

6. Получите из целлюлозы метилцеллюлозу, этилцеллюлозу, условно считая, что алкилированию подвергаются все гидроксильные группы.

7. С помощью каких химических реакций можно отличить сахарозу от мальтозы?

8. Напишите схемы строения крахмала и целлюлозы.

9. Напишите гидролиз сахарозы, используя структурные формулы. В чем заключается явление инверсии? Что такое инвертный сахар?

10. Напишите реакции взаимодействия лактозы со следующими веществами: ангидридом этановой кислоты, гидроксиламином, фенилгидразином.

11. Напишите схему образования озазона целлобиозы.

12. Напишите уравнение реакции гидролиза целлобиозы.

13. Напишите схемы образования следующих дисахаридов:

а) целлобиозы; б) сахарозы.

14. Как реагирует сахароза с избытком уксусного ангидрида?

15. Напишите схему получения оксима целлобиозы?

16. Какова причина растворения Cu(OH)₂ в растворе сахарозы?

Как называются соединения образующиеся при этом?

17. Напишите схему синтеза из 2 молекул глюкозы: а) a-глюкопиранозил-a-глюкопиранозида (трегалозы); б) a-глюкопиранозил-глюкозы (мальтозы); в) b-глюкопиранозил-глюкозы (целлобиозы).

18. Напишите схему превращения a-глюкопиранозил-b-фруктофуранозида (сахарозы) в инвертный сахар: объясните название «инвертный».

19. Напишите схему гидролиза (в присутствии кислоты) b-галактопиранозил-глюкозы (лактозы, молочного сахара).

20. Как реагирует амилоза с диметилсульфатом? Напишите схему реакции.

21. Напишите структурную формулу фрагмента амилопектина.

22. Напишите схемы синтеза триацетата и тринитрата целлюлозы (используя формулу Хеуорса для изображения остатка глюкозы).

 

Тема №3 «Пептиды. Белки»

 

Согласно общепринятой теории молекула белка состоит из остатков a-аминокислот, связанных между собой пептидными связями:

Качественными реакциями на белки являются:

а) биуретовая реакция; б) ксантопротеиновая реакция;

в) реакция Миллона; г) нингидринная реакция.

 

Лабораторная работа № 5

Цветные реакции на белки

Цель работы: изучение химических свойств аминокислот и белков.

Реактивы и оборудование :

1) гликокол – 0, 2н,

2) метилрот – 0, 2%,

3) CuO – порошок,

4) 2н раствор NaOH,

5) раствор белка,

6) 2н раствор HNO₃,

7) 2н раствор NH₄OH,

8) раствор Pb(CH₃COO)₂,

9) раствор формалина 40%,

10) тонкие стеклянные капилляры,

11) пробирки и спиртовки.

 

Опыт 5.1 Цветные реакции на белки

а) Биуретовая реакция.

К 1 -2 мл раствора белка добавить равный объем щелочи и затем 3-4 капли медного купороса. Как изменится окраска раствора?

б) Ксантопротеиновая реакция.

К 1 мл раствора белка прибавить 0, 2-0, 3 мл азотной кислоты. Затем нагреть до кипения и кипятить 1-2 минуты. При добавлении нескольких капель аммиака как изменится окраска раствора?

С помощью этой реакции обнаруживают наличие в белке ароматических ядер, т.е. остатков таких аминокислот, как фенилаланин, тирозин и триптофан.

Изложить ваши наблюдения и написать структурные формулы:

а) фенилаланина, тирозина и триптофана, б) образование дипептида из аланина.

Опыт 5.2 Реакция на обнаружение серосодержащих аминокислот

(цистин, цистеин)

Налить в пробирку 3 капли раствора уксуснокислого свинца и 1-2 капли едкого натра до растворения образовавшегося осадка гидроокиси свинца.

Прибавить 3-4 капли белка исмесь осторожно нагреть. Раствор начинает темнеть (выделяется осадок сернистого свинца).

 

Лабораторная работа №6

Денатурация белков

При необратимом осаждении белков нарушается их вторичная, третичная и четвертичная структуры, белки денатурируют и утрачивают свои биологические и физико-химические свойства.

Денатурация белков может быть вызвана рядом физических и химических факторов: повышением температуры, взаимодействием с солями тяжелых металлов, концентрированными минеральными кислотами, продолжительным воздействием органических растворителей и другими.

Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев наблюдается ренатурация – восстановление исходной конформации молекулы белка и его природных свойств.

 

Опыт 5.3 Осаждение белков органическими растворителями

Добавление смешивающих с водой нейтральных органических растворителей, например этанола, ацетона, хлороформа, уменьшает растворимость большинства белков в воде и вызывает выпадение их в осадок. Органические растворители снижают диэлектрическую постоянную белковых растворов, вследствие чего усиливается притяжение между белковыми частицами, способствующее агрегации белков и снижению их растворимости. Кроме того органические растворители нарушают гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы.

Кратковременное воздействие на белки органическими растворителями при низких температурах вызывает их обратимое осаждение. Однако длительное воздействие высоких концентраций органических растворителей при относительно высоких температурах (+20° и выше) приводит к денатурации белков, необратимому осаждению.

Ход работы

1. К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1, 5-2 мл 96%-ного этилового спирта и встряхивают пробирку. Выпадает белый осадок белка.

2. К 1 мл раствора яичного альбумина добавляют 1, 5-2, 0 мл 80%-ного ацетона и встряхивают пробирку. Выпадает осадок белка.

 

Опыт 5.4 Денатурация белков при нагревании

Белки подвергаются денатурации и выпадают в осадок при нагревании их растворов до температуры выше 50-60°С. Свернувшиеся белки не могут быть снова переведены в раствор, так как при нагревании нарушаются связи, стабилизирующие четвертичную, третичную и вторичную структуры белковых молекул, изменяются их физико-химические свойства, в том числе уменьшается их способность к гидратации.

В изоионном состоянии при нагревании увеличивается степень денатурации белков. Так как изоионная точка для большинства белков находится в слабокислой среде, то небольшое подкисление раствора белка способствует более полной его коагуляции при нагревании.

Ход работы

В две пробирки вносят по 1 мл раствора яичного альбумина. В одну из пробирок добавляют 1 каплю 1%-ного раствора уксусной кислоты. Обе пробирки нагревают. В пробирке где раствор подкислен, свертывание белка происходит быстрее. Объясните результаты наблюдения и разницу в появлении осадков.

 

Опыт 5.5 Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами

Концентрированные минеральные кислоты (H₂SO₄, HCl, HNO₃ и др.) вызывают необратимое денатурационное изменение белков, следствием чего является агрегация белковых молекул и их осаждение.

Денатурирующее действие минеральных кислот может быть объяснено их воздействием на функциональные группы белка. Минеральные кислоты, например, превращают отрицательную группу –СОО^- в недиссоциированную группу –СООН, что приводит к нарушению ионных связей /солевых мостиков/ и, как следствие, к разворачиванию полипептидных цепей.

При длительном воздействии концентрированными минеральными кислотами могут произойти гидролиз белка (разрыв пептидных связей), а также реакции нитрования, окисления, сульфирования, конденсации и др.

 

Ход работы

1. К 1 мл концентрированной серной кислоты осторожно, под тягой, по стенке пробирки добавляют 1 мл раствора яичного альбумина так, чтобы не смешивать жидкости.

На границе соприкосновения двух жидкостей образуется белое кольцо выпавшего в осадок белка. При осторожном смешивании жидкостей осадок не исчезает.

2. В двух других пробирках проводят такие же опыты, но с концентрированными соляной и азотной кислотами.

 

Опыт 5.6 Осаждение белков органическими кислотами

Белки из растворов необратимо осаждают органическими кислотами. Трихлоруксусная кислота ССl₃СООН и сульфосалициловая кислота С₆Н₃(ОН)(СООН)SO₃H являются очень чувствительными, специфическими реактивами на белок и широко применяется с этой целью.

Осаждение белков трихлоруксусной кислотой часто применяют для полного удаления белков из биологических жидкостей (например, из сыворотки крови), продукты их распада при этом остаются в растворе.

Ход работы

1. В пробирку вносят 1 мл раствора белка и добавляют несколько капель 10%-ного раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

2. В другую пробирку вносят 1-2 мл раствора белка и добавляют несколько капель сульфосалициловой кислоты. Наблюдают выпадение белка в осадок.

 

Опыт 5.7 Осаждение белков солями тяжелых металлов

При действии небольших концентраций солей тяжелых металлов (Сu⁺², Pb⁺², As⁺³, Hg⁺², Bi⁺³) на растворы белка происходит денатурация белковых молекул. Осаждение денатурированного белка обусловлено адсорбцией иона тяжелого металла на поверхности белковой молекулы и образованием нерастворимых в воде комплексных соединений. Кроме того, тяжелые металлы снимают электрический заряд и глубоко изменяют вторичную и третичную структуру макромолекул белка, образуют связи между функциональными группами молекул.

Существуют определенные границы концентраций солей тяжелых металлов, при которых комплекс белка с солью тяжелого металла переходит в осадок, либо находится в растворимом состоянии.

Ход работы

1. К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 1%-ного раствора сульфата меди. Выпадает осадок, который растворяется в избытке (7-10 мл) раствора этой соли.

2. К 2 мл раствора яичного альбумина добавляют 5 капель 0, 5%-ного раствора уксуснокислого свинца. Выпадает осадок, который растворяется также в избытке раствора этой соли.

е) осаждение белков специфическими реактивами

Необратимое осаждение белков можно вызвать воздействием на их растворы различными специфическими реактивами: танином, пикриновой кислотой, гексацианоферратом (II) калия и др.

Механизм осаждения белков этими реактивами заключается в образовании нерастворимых комплексных соединений с аминными группами белков.

Ход работы

1. Осаждение белков танином

В пробирку вносят 1 мл раствора яичного альбумина, добавляют несколько капель 1%-ной уксусной кислоты и 1 мл насыщенного раствора танина. Выпадает осадок желтовато-серого цвета.

2. Осаждение белков пикриновой кислотой

К 1 мл раствора яичного альбумина, подкисленного уксусной кислотой, добавляют несколько капель насыщенного раствора пикриновой кислоты. Образуется желтоватый осадок белка.

3. Осаждение белков гексацианоферратом (Ι Ι ) калия

К 1 мл раствора яичного альбумина, подкисленного уксусной кислотой, по каплям добавляют 5%-ный раствор гексацианоферратом (Ι Ι ) калия. Выпадает осадок белка.

 

Лабораторная работа № 7

Ферменты

Ферменты – это биологические катализаторы белковой природы, образуемые живой клеткой. Ускоряя многочисленные реакции, протекающие в живом организме, ферменты являются движущей силой обмена веществ.

Все ферменты в зависимости от типа катализируемой реакции подразделяются на 6 классов:

1 Оксидоредуктазы – катализируют окислительно - восстановительные реакции.

2 Трансферазы – катализируют реакции переноса различных химических групп с одной молекулы на другую.

3 Гидролазы – катализируют реакции гидролиза.

4 Лиазы – катализируют реакции отщепления от субстратов негидролитическим путем той или иной химической группы с образованием двойной связи или присоединение химической группы по месту двойной связи.

5 Изомеразы – катализируют реакции изомеризации органических соединений.

6 Лигазы, или синтетазы – катализируют реакции синтеза веществ, сопровождающиеся расщеплением высокоэнергетической связи в молекуле АТФ или аналогичного нуклеозидтрифосфата.

 

Цель работы: в ыяснить химическую природу, отдельные свойства ферментов. Изучить основные факторы определяющие ферментативную активность.

 

Реактивы и оборудование:

1) 1 % раствор крахмала;

2) 1% раствор сахарозы,

3) слюна;

4) 1% раствор KI (или 1 % раствор Люголя);

5) 1% раствор CuSO₄;

6) 10% раствор NaOH

7) картофель сырой и вареный;

8) раствор пероксида водорода

9) штатив с пробирками;

10) водяная баня;

11) Термометр;

12) Электроплитка.

 

Опыт 7.1. Ферментативный гидролиз крахмала

В пробирку собрать 2 – 3 мл. слюны, разбавить ее водой в 5 – 6 раз.

Взять 3 пробирки, пронумеровать и налить в каждую примерно 1 мл. раствора слюны.

Раствор слюны в первой пробирке прокипятить, во вторую пробирку добавить 1 мл. раствора CuSO₄ и раствора NaOH. В первые две пробирки прилить по 5 мл. раствора крахмала, а в третью раствора сахарозы. Поставить все три пробирки в водяную баню (39 – 41^оС) на 15 минут затем достать, охладить до комнатной температуры, добавить в первые две пробирки по одной капле раствора Люголя. В тех пробирках, где нет синего (сине – фиолетового) окрашивания и с раствором третьей пробирки проделать реакцию Троммера..

В две пробирки налить 5 капель раствора крахмала и добавить 3 капли воды: в первую- добавить раствор KI, во вторую – 2 капли раствора CuSO₄ и 2 - 3 капли раствора NaOH.

Полученные результаты занести в таблицу.

№ п/ п	Субстрат	Ферменты	Дополните-льный фактор	Результаты опыта	Выводы
Реак-ция с йодом	Реак-ция Троммера
	крахмал крахмал сахароза крахмал крахмал	амилаза амилаза амилаза вода вода	кипячение

Опыт 7.2 Открытие каталазы

Каталаза – фермент, который разлагает пероксид водорода. Относится к классу оксидоредуктаз. Каталаза является сложным ферментом, состоящим из белкового комплекса и группы, содержащей железо.

Каталаза расщепляет перекись водорода на молекулярный кислород и воду 2H₂O₂ → O₂ + 2H₂O

 

В пробирку поместить 10 капель Н₂О₂ и кусочек сырого картофеля. В другую пробирку - 10 капель Н₂О₂ и кусочек вареного картофеля.

Отметить происходящие изменения.

 

Контрольные вопросы

1. Классификация белков. Простые и сложные белки.

2. Строение белковой молекулы: первичная, вторичная, третичная и четвертичная структура белка.

3. Что такое денатурация белков?

4. Какие вы знаете денатурирующие факторы и в чем особенности их действия?

5. Какие структуры белковых молекул изменяются при денатурации?

6. Является ли денатурация обратимым процессом?

7. Какие методы определения аминокислотной последовательности вы знаете?

8. В чем заключается стабилизация вторичной и третичной структур.

9. Что значит окислительное дезаминирование?

10. Какие белки называются глобулярными? Приведите примеры глобулярных бедков.

11. Какие белки называются фибриллярными? Приведите примеры фибриллярных белков.

Упражнения по теме «Белки».

1. Укажите методы, которые применяют для определения последовательности аминокислотных остатков в пептиде. Проиллюстрируйте их на примере глицилаланилфенилаланина.

2. Напишите формулы: а) изомерных дипептидов, составленных из глицина и аланина; б) изомерных трипептидов, составленных из глицина, аланина и серина. Назовите их.

3. Приведите примеры, позволяющие определять N-и C-концевые аминокислоты в полипептиде. Проиллюстрируйте их на примере трипептида – фенилаланилвалилглицина.

4. Напишите структурную формулу трипептида, при полном гидролизе которого образуется глицин, аланин и цистеин, а при частичном гидролизе- аланилглицин и глицилцистеин.

5. Используя метод защиты аминогруппы карбобензоксихлоридом (С₆Н₅СН₂ОСОСI), осуществите синтез трипептидов; а) глицилаланилглицина; б) аланилглицилфенилаланина.

6. Укажите наиболее характерные свойства молекул белка.

7. Какие белки называются гормонами?

8. Что такое ферменты?

9. Как осуществляется синтез белков в живых клетках?

 

⇐ Предыдущая12345Следующая ⇒

Поделиться: